Exploring effective components and therapeutic mechanism of Chaihu-Guizhi-Ganjiang decoction in treatment of chronic non-atrophic gastritis by UPLC-Q-TOF-MS/MS combined with network pharmacology

慢性非萎缩性胃炎（CNAG）作为慢性胃炎的一种类型，在中国发病率高达49.3%，严重影响患者的生活^[1]。柴胡桂枝干姜汤（CGGD）源自张仲景的《伤寒论》，由柴胡、桂枝、干姜、天花粉、黄芩、牡蛎、甘草七味药组成，主治胆热脾寒之症^[2]。现代研究发现，柴胡桂枝干姜汤治疗消化系统疾病效果显著^[3]。然而，目前的研究多聚焦于典型病案分析与临床疗效上，缺乏其体内外成分的表征，更未见其治疗CNAG的机制研究^[4]。

因此，本研究基于血清药物化学分析方法，采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（UHPLC-Q-TOF/MS）技术对柴胡桂枝干姜汤的入血成分进行分析，同时结合网络药理学技术对其治疗CNAG的作用机制进行探讨，为后续开展实验验证提供数据支撑。

柴胡（甘肃，批号：1051843）、黄芩（山东，批号：1032223）、干姜（四川，批号：1045063）、天花粉（河北，批号：1037043）、桂枝（广西，批号：1035433）、牡蛎（广东，批号：1041073）、炙甘草（内蒙古，批号：1040593）、清半夏（甘肃，批号：1042863）均购自上海蔡同德中药饮片有限公司。汉黄芩苷（批号：O0903AS）购自大连美仑生物技术有限公司；柠檬酸（批号：SM0425GA14）购自上海源叶生物科技有限公司。质谱级甲醇、乙腈购自德国Merck公司；质谱级甲酸购自美国Fisher公司；纯净水购自中国屈臣氏公司。1%氨水、脱氧胆酸钠、无水乙醇、二甲苯、双氧水（货号：10011218）购自国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸（PH 6.0）抗原修复液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、苏木素染液（货号：R1004）购自上海睿宝和生物科技有限公司；STAT3抗体（货号：9139）与PTGS2抗体（货号：12282）购自Cell Signaling Technology公司；TNF-α抗体（货号：ab6671）与IL-6抗体（货号：ab9324）购自abcam公司。

UHPLC-Q-TOF/MS，包含1290 Infinity型UHPLC及6530型Q-TOF/MS系统（美国Agilent公司）；L-200型冷冻干燥机（瑞士Buchi公司）；Centrifuge 5810 R型高速冷冻离心机、Mini spin微型离心机（德国Eppendorf公司）；BSA124S-CW型分析天平（德国Sartorius公司）；SK7200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；VX200涡旋振荡器（美国Labnet公司）脱水机与包埋机（浙江金华科迪仪器设备有限公司）；RM2016型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）。

分别精密称取汉黄芩苷和柠檬酸对照品1 mg，加入适量甲醇，配制成二者浓度为10 μg/ml的混合对照品溶液备用。

将柴胡、黄芩、干姜、桂枝、天花粉、牡蛎、炙甘草、清半夏按照8∶3∶2∶3∶4∶10∶2∶2的配比称取后，加入8倍量水浸泡过夜，回流提取1 h，重复2次，滤过，合并滤液，100 ℃下常压浓缩得到浸膏，出膏率为33.77%。精密称取浸膏2.45 g，加入24.5 ml 20%甲醇溶解，超声处理（500 W，40 kHz）30 min，放冷，摇匀，提取液于3 000 r/min离心10 min，取上层溶液于1.5 ml离心管中，于14 500 r/min离心10 min，静置10 min后，再次取上清液14 500 r/min离心10 min，吸取上清液150 μl于进样小瓶中待分析。

SPF级雄性SD大鼠18只，体重为200～220 g，购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号为SCXK（苏）2021-0013。饲养环境温度20～24 ℃，湿度50%～70%，12 h光照与黑暗交替循环，自由饮食进水。适应性喂养1周后，随机分为正常组（6只）、模型组（6只）与给药组（6只）。除正常组外，其余两组大鼠每日饮用0.02%氨水、每周5次20 mmol/L脱氧胆酸钠溶液灌胃、饥饱交替饮食（禁食1 d，饱食2 d），连续给予10周。最后4周内，给药组每日给予柴胡桂枝干姜汤36.72 g/kg（相当于临床剂量的4倍）灌胃，正常组大鼠每日给予同体积生理盐水灌胃。末次给药后，分别于第 0.5、1 、2 、4、8 h进行眼内眦取血 1.0 ml 置于抗凝管中，于4 ℃下3 500 r/min 离心15 min，取上清液，将不同组别血浆分装，置于−80 ℃冰箱保存；同时取不同组别大鼠胃组织置于多聚甲醛中固定，待后续免疫组化分析。

将同一只大鼠不同时间点的血浆各取50 μl混合，加入4倍体积（含200 ng/ml华法林）甲醇溶液，涡旋振荡3 min，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min，取上清液后继续在4 ℃、13 000 r/min条件下离心10 min，取上清液，置于冷冻干燥机中冻干。残渣用130 μl 80 %甲醇溶液复溶，涡旋振荡3 min，在4 ℃、13 000 r/min条件下继续离心10 min，收集上清液至进样小瓶待进样分析。

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱温为35 ℃；流动相为0.1 %甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~15 min，5 %~22 %B；15~20 min，22 %~24 %B；20~28 min，24 %~40 %B；28~47 min，40 %~95 %B；47~50 min，95%B）；流速为0.3 ml/min；检测波长为254、280、360 nm；进样量3 μl。

电喷雾离子源（ESI），分别在正、负离子模式下采集数据；离子源温度350 ℃；毛细管电压分别为3.5 kV（正离子）和4.0 kV（负离子）；雾化气压力45 Psi；干燥气流速11 L/min；鞘气流速11 L/min；鞘气温度350 ℃；碎片电压140 V。

通过中国知网（CNKI）、重庆维普、PubMed、Web of Science等数据库查阅国内外最新文献，采集柴胡桂枝干姜汤组方8种药材的化学成分信息，构建各单味药材及柴胡桂枝干姜汤化学成分数据库。利用Agilent MassHunter Qualitative Analysis 10.0、MSdial 4.70及MSfinder 3.60等软件，结合相关标准品二级碎片信息、相关文献及公共数据库Massbank、PubChem及HMDB的一、二级离子碎片信息对化学成分进行分析鉴定，筛选出质量数匹配容差< ±8 ppm的化学成分，并对其来源药材进行归属。同样的，以体外成分分析结果为数据库，对其入血原型成分进行识别。

通过PubChem网站获取已鉴定的柴胡桂枝干姜汤入血化学成分的分子结构式与Canonical SMILES号，导入SwissTargetPrediction网站 ^[5]，获取其作用的靶点信息，并与Uniprot网站比对获取其基因信息^[6]。分别在OMIM、DrugBank、GeneCard、DisGeNet网站以“Chronic Gastritis”为关键词，搜索整理疾病相关靶点^[7-9]。在线绘制韦恩图，输入成分作用靶点与疾病相关靶点，获取交集靶点。

将获取到的交集靶点导入STRING 12.0数据库，Organisms选择“Homo sapiens”，最低要求交互分数设为0.4，生成靶点蛋白间相互作用的关系网络，导出数据后使用Cytoscape v3.9.1软件，计算其度值，按照度值大小，构建PPI网络互作图^[10]。

将交集靶点导入DAVID在线数据库进行GO生物富集分析及KEGG通路分析，物种选择为“Homo sapiens”，Select Identifier选择为“Official_Gene_Symbol”，将结果按照P值大小进行排序，选取P<0.05的前10条通路进行可视化处理^[11]。

将上述结果导入Cytoscape v3.9.1，构建“疾病-成分-靶点-通路”网络关系可视化图。

应用免疫组化方法对上述靶点进行验证。将胃组织切片依次放入二甲苯I和二甲苯II中浸泡15 min，而后依次放入无水乙醇I、无水乙醇II、85%酒精和75%酒精中浸泡5 min，最后用蒸馏水洗将石蜡切片脱蜡，高温修复抗原。加入3%的过氧化氢溶液，室温避光孵育25 min，加入3%的牛血清进行封闭。分别加入一抗TNF-α、IL-6、STAT3和PTGS2，在4 ℃条件下孵育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗覆盖组织，室温孵育50 min。经DAB显色、细胞核复染、脱水封片后进行显微镜镜检，图像采集分析。

按“1.8”项下方法，在柴胡桂枝干姜汤中共表征出248种化学成分。在此基础上，通过比较含药大鼠血浆、体外成分以及空白大鼠血浆，我们进一步确定了柴胡桂枝干姜汤的24种入血原型成分，其中2种经过对照品比对，主要包含黄酮苷类11种，脂肪酸类3种，有机酸类2种，姜辣素类2种，黄酮类2种，脂类、三萜类、苯丙素类及氨基酸类各1种，其具体信息参见表1。总离子流图及入血成分提取离子流图见图1。

按“1.9.1”项下方法，分别获得成分靶点405个，疾病相关靶点328个。将二者取交集，得到23个交集靶点，如图2所示。

经过“1.9.2”项下方法分析23个交集靶点，去除游离节点（GPR35）后，得到22个蛋白节点和99条相互作用连线，平均度值8.61。导入Cytoscape可视化，度值大则节点大且色深，最终筛选出肿瘤坏死因子（TNF）、白介素-6（IL-6）、信号转导和转录激活剂3（STAT3）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）4个核心靶点，详见图3。

通过DAVID数据库，对23个交集靶点进行了GO功能及KEGG通路富集分析。在FDR<0.05条件下，筛选出48条GO功能结果：生物进程（BP）24条，如炎症反应、对异生素刺激的反应等；细胞组分（CC）9条，如细胞质、质膜等；分子功能（MF）15条，如酶结合、血红素结合等（图4）。同时，富集到27条KEGG通路，涉及癌症途径、IL-17信号通路等（图5）。

将上述24种化学成分，23个交集靶点及20条KEGG通路导入Cytoscape进行可视化处理，共得到64个节点，233条边。度值大则节点大且色深，具体结果见图6。

通过免疫组化对网络药理学分析的结果进行进一步的验证，如图7所示，模型组大鼠胃组织中TNF-α、IL-6、STAT3及PTGS2表达较正常组显著升高，经CGGD治疗后表达降低。

柴胡桂枝干姜汤源自小柴胡汤，关于其所主病机的探讨众说纷纭，譬如少阳病兼汗下津伤、少阳病兼表邪未解等^[12]。自刘渡舟提出其病机核心为“胆热脾寒”后，逐渐被大多数医者所认可。在此基础上，众多医者应用柴胡桂枝干姜汤治疗消化系统疾病特别是CNAG，均取得了满意的疗效^[13]。柴胡和黄芩作为方中君药，柴胡畅气散火，黄芩清热燥湿、泻火解毒，二者合力和解少阳，对抗“胆热”。干姜和桂枝作为臣药，可以温中散寒，共解“脾寒”^[14]。为了深入探究该方治疗胆热脾寒型CNAG的物质基础，本研究首次采用UHPLC-Q-TOF/MS技术，鉴定出其248种体外化学成分及24种入血原型成分。在单体分子方面，槲皮苷通过多种机制发挥胃保护作用，如缓解炎症、减轻胃蛋白酶及胃酸分泌等；芫花素作为新兴化合物，能抑制活性氧（ROS）及促炎物质（如IFN-γ等）的产生，这些都有助于黄芩的清“热”作用^{[15, 16]} 。6-姜辣素是干姜中的高药理活性成分之一，已证实具有抗肿瘤、抗增殖、抗侵袭和抗炎作用，涉及到Bax/Bcl2、p38/MAPK、Nrf2、TNF-α, ERK1/2、SAPK/JNK、ROS/NF-κB/COX-2等等；同时，它还能改善大鼠胰岛素抵抗及异位脂质沉积，进而改善能量代谢，这可能是干姜抗“寒”作用的机制之一^{[17, 18]}。甘草虽为使药，其化学成分亦具有多种药理活性，如甘草次酸通过PI3K/AKT途径发挥抗炎作用并能够抑制磷脂酶A2^{[19, 20]}。同时，甘草次酸还常作为局部抗炎剂使用^[21]。

网络药理学结果进一步表明，柴胡桂枝干姜汤的主要作用靶点包括TNF、IL-6、STAT3和PTGS2。TNF，由巨噬细胞分泌的一种小分子蛋白，存在TNF-α和TNF-β两种亚型。TNF-α和IL-6是经典的促炎因子，其中TNF-α诱导多种信号，主要通过NF-κB调节的蛋白发挥促炎作用，激活产生IL-6的转录因子，并能自诱导其表达^{[22, 23]}。TNF-α与IL-6的过度表达会增加慢性胃炎的风险，且胃炎治愈后其表达受抑。不仅仅是TNF-α, 在慢性胃炎大鼠中，TNF-β表达也升高^[24]。STAT3磷酸化及其相关通路的持续激活促进胃黏膜肠化生^[25]。PTGS2（即COX-2）的表达量与幽门螺旋杆菌感染及胃黏膜炎症程度密切相关，是非甾体抗炎药的作用靶点^[26]。进一步的免疫组化结果证实，柴胡桂枝干姜汤通过调节这些靶点表达发挥治疗作用。

KEGG通路富集分析表明，柴胡桂枝干姜汤治疗CNAG的交集靶点主要集中在IL-17、AGE-RAGE、C型凝集素受体和亚油酸代谢等通路。IL-17信号通路除激活NF-κB及MAPK通路增强炎症反应外，还可维持黏膜免疫和屏障完整性促进消化道上皮的修复^{[27, 28]}。AGE-RAGE通路被认为与慢性炎症反应与氧化应激相关，可通过PI3K/AKT、JAK/STAT通路等诱导细胞损伤^[29]。C型凝集素受体（CLR）调节细胞、发育、稳态和免疫反应，能激活NLRP3、NLRC4或者caspase 8炎症小体，导致IL-1β的产生^[30]。亚油酸的混合物共轭亚油酸（CLA）在胃内形成硝基共轭亚油酸（NO₂-CLA），可以减弱NF-κB依赖性基因的表达，减少促炎因子IL-6和MCP-1的产生，保护组织免受活性氧的破坏^[31]。

综上所述，本研究首次采用UHPLC-Q-TOF/MS技术对柴胡桂枝干姜汤的化学成分及入血成分进行了表征，揭示其疗效的物质基础。结合网络药理学，深入探讨了该方剂在治疗CNAG的疗效机制，为其进一步研究提供了科学依据和理论支撑。然而，柴胡作为该方的主要药材，可能受到体内吸收及代谢的影响，其原型入血成分即使通过对照品进行比对也未能找出，推想极有可能生成新的代谢物来发挥作用，也为后续研究开辟了新的探索空间。