Effects of hawthorn and melanoidins on the in-vitro growth of Bifidobacterium and E.coli

低温培养箱（美墨尔特有限公司，德国），生物安全柜（赛默飞世尔科技公司，美国），高压灭菌锅（三洋公司，日本），纯水机（密理博公司，美国），厌氧罐（北京陆桥技术股份有限公司，北京）；紫外可见分光光度计（上海佑科仪器仪表有限公司，上海）；7890B型气相色谱仪（安捷伦科技有限公司，美国）；HP-FFAP型毛细管柱（货号：19091F-413，安捷伦科技有限公司，美国）；GM900型非接触红外测温仪（深圳聚茂源科技有限公司，深圳）。

MRS固体培养基、PYG液体培养基、厌氧产气袋和厌氧指示剂（北京陆桥技术股份有限公司）；蛋白胨、酵母粉（英国OXOID公司）；乙酸（98.85%，国药集团化学试剂有限公司，中国）；其余试剂均为分析纯。

净山楂饮片（四川同善堂中药饮片有限责任公司，批号：180501）；双歧杆菌（GDMCC1.1258）、大肠杆菌（ATCC25922）（中国科学院微生物研究所）。

参照2015版《中国药典》一部山楂项下制备焦山楂。取生山楂150 g，中火（380～420）℃炒制10 min，至药材表面呈焦黄或焦褐色，内部颜色加深，并具有焦香气味，取出，常温封存，即得。

（1）生山楂和焦山楂浸膏的制备

取生山楂和焦山楂各100 g进行水浸提，料液比为1:15，浸提8 h，浸提2次。生山楂和焦山楂浸提液分别在4 ℃下以3 600 r/min离心10 min，取上层清液各1 000 ml。将500 ml上层清液进行蒸发浓缩至胶状，停止加热，余温使其自然干燥，得生山楂浸膏13.75 g，焦山楂浸膏14.02 g。

（2）焦山楂中类黑素的提取

取焦山楂100 g，按照“1.2.2”项中⑴的方法提取得到1 000 ml上层清液。取500 ml上层清液蒸发浓缩得棕褐色浓缩液50 ml，进行大孔树脂吸附，室温吸附流速1.5 ml/min，60%乙醇作为洗脱剂，洗脱至色谱柱上无棕色为止，收集洗脱液500 ml。洗脱液蒸发浓缩至胶状，停止加热，余温使其自然干燥，得焦山楂类黑素浸膏13.12 g。

（3）类黑素的紫外检测

取类黑素浸膏1 g，蒸馏水溶解定容至100 ml，取10 ml溶液，分别定容至50 ml；因波长420 nm处是类黑素的特征吸收波长，测其特征吸收下的吸光度值，焦山楂类黑素浸膏吸光度值为0.492，说明焦山楂中类黑素提取成功。

（1）双歧杆菌测试菌菌液的制备

以接种环自双歧杆菌标准菌种管挑取菌种，划线接种至MRS固体培养基，36 ℃厌氧培养48 h，挑取单菌落接种至PYG液体培养基，36 ℃厌氧培养48 h，以生理盐水调整浓度至1.0麦氏浓度，作为受试菌初始菌液，按10:1浓度加入试验体系。

（2）大肠杆菌测试菌液的制备

以接种环自大肠杆菌标准菌种管挑取菌种，划线接种至LB固体培养基（配方：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉15 g，加入1 L蒸馏水，以5 mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，121 ℃高压灭菌15 min备用），36 ℃有氧培养24 h，挑取单菌落接种至LB液体培养基（配方：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，加入1 L蒸馏水，以5 mol/L氢氧化钠调节pH至7.0，121 ℃高压灭菌15 min备用），36 ℃有氧培养6 h，以生理盐水调整浓度至0.5麦氏浓度，作为受试菌初始菌液，按10:1浓度加入试验体系。

（3）样本药液的处理

准确称取生山楂，焦山楂和类黑素浸膏各10 g，加入100 ml去离子水，超声振荡处理，期间手动震摇数次，直至样本完全溶解，配制10%母液，并经115 ℃高压灭菌处理15 min后4 ℃保存备用。

（4）乙酸含量测定

①样本前处理：将经过微生物培养的溶液1 ml，经过高速离心机4 000 r/min离心，之后再过0.2 µm有机相滤头于进样瓶，样品量大于0.5 ml，或者使用内插管，上机测定。

②标准溶液及标准曲线：称取60.05 g乙酸于100 ml容量瓶，用一级水定容至刻度，摇匀，作为储备标准溶液，浓度为101.33 mmol/L。将标准储备溶液依次稀释1、3、10、20、100、200倍得标准工作溶液。

③色谱条件：洗针液为甲醇，进样量0.5 µl，进样口温度240 ℃；压力6.1219 psi；分流比10:1，流量为1.0 ml；升温程序：初始温度：100 ℃，保持0 min；梯度一：以5 ℃/min升到120 ℃，保持0 min；梯度二：以20 ℃/min升到200 ℃，保持10 min；总运行时间：18 min；检测器（FID）温度：240 ℃；空气流量：300 ml/min；氢气流量：33 ml/min；尾吹氮气流量：20 ml/min；数据采集频率/峰宽：20 Hz/0.01 min。

使用SPSS 22.0进行独立样本t检验，数据以平均数±标准差（$\bar x \pm s$）表示，P<0.05认为存在显著性差异。

乙酸浓度在0.51～101.33 mmol/L线性关系良好。以乙酸峰面积（Y）为纵坐标，乙酸含量（X）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=3.670 5X−4.300 8，r=0.999 0，残留标准误差为6.644 2，如图1所示。

生山楂和焦山楂加速生长期双歧杆菌的生长繁殖，达稳定期后，由于生山楂中多种物质被分解，菌群产生大量代谢废物，于衰亡期加速双歧杆菌的衰亡；由于焦山楂中多种物质被分解，菌群产生大量代谢废物，于衰亡期加速双歧杆菌的衰亡；但因焦山楂中存在类黑素且其他物质较少，衰亡速率慢于生山楂组；类黑素加速生长期双歧杆菌的生长繁殖，但由于无其他物质，其生长速率慢于生山楂组，但在衰亡期中明显改变双歧杆菌生长规律，使生长期延长（生长速率变缓），双歧杆菌衰亡延后，如图2。

生山楂促进大肠杆菌生长期前期的生长繁殖，但由于代谢废物的逐渐增加，乙酸堆积，使生长速率逐渐变缓；焦山楂促进大肠杆菌生长期前期的生长繁殖，但由于类黑素及代谢废物的影响使生长期变短，稳定期提前；类黑素对大肠杆菌生长期前期无明显影响，但生长期后期明显促进大肠杆菌的生长繁殖，如图3所示。

《中国药典》一部中对焦山楂炮制方法为：取净山楂，中火条件下炒至药材表面焦褐色，内部焦黄色，并具有焦香气味。因无可控工艺参数，焦山楂炮制过程中易出现饮片表面以及内部颜色不均一，山楂炒制成品质量不稳定等情况。结合课题组前期实验，采用分别100、150、200和250 g净山楂为炮制对象，中火条件为（340～380）℃、（380～420）℃和（420～460）℃，炮制时间为8、10、12和14 min；不同质量同一批号的净山楂在不同的中火条件下炮制不同的时间，采用非接触式红外测温仪检测炒制温度，并以炒锅初温和山楂药材炒制末温辅助控温。实验筛选出150 g净山楂中火条件（380～420）℃下炒制10 min，可得到质量稳定，颜色均一的焦山楂。

　　类黑素的提取方法主要是水浸提法，Borrelli等^[8]在90 ℃条件下，采用1:6料液比，对咖啡中的类黑素进行水提；Langner等^[9]在室温条件下采用1:12料液比，水浸提1 h，提取到土豆类黑素粗制品。类黑素成分复杂，提纯困难。目前，主要的纯化方法有大孔树脂、超滤和凝胶层析等方法。何健^[10]等发现X-5大孔树脂是曲霉型豆豉类黑素的最佳吸附树脂。秦礼康等^[11]利用S-8树脂分离得到豆豉两个类黑素组分。本实验在水浸提法的基础上进行改良，最终获得最优提取工艺。结果显示类黑色素在420 nm处有较强吸收^[12]。

实验采用气相色谱法检测菌群代谢物乙酸的含量。参照文献^[13-14]，结果显示其色谱条件对于本样品分析效果不佳；在柱温选择中，恒温法对乙酸检测效果不理想，峰形不稳定，因此实验采取梯度升温。经反复试验，最终获得正文中的检测参数，分离效果好，可作为本实验乙酸检测条件。