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在正常条件下，大部分肝细胞处于静止状态（G0期），通常很少进入有丝分裂期。一旦肝细胞受到手术切除和药物等应激的刺激，它们会迅速对促分裂原产生反应，过渡到有丝分裂期，并开始增殖[1-4]。肝细胞增殖不仅是肝脏自我修复和再生的基础，也是应对慢性肝炎、肝硬化以及药物性肝损伤（DILI）等多种损害的重要机制。研究表明，肝脏出现病理性损伤后产生多种肝细胞因子，例如纤维蛋白原样蛋白（FGL1）、Hepassocin、肝细胞生长因子（HGF）等，在促进肝细胞增殖方面发挥重要作用[5-8]。例如，FGL1通过激活细胞增殖相关的信号通路促进肝细胞的再生，从而加速肝脏的修复[9]。此外，Hepassocin通过自分泌机制促进肝细胞生长[6]。这些研究提供了肝脏疾病治疗的新思路，尤其是调控这些肝细胞因子来加速肝功能的恢复。
Orosomucoid-1（ORM1），也称为α-1-酸性糖蛋白1（AGP1），作为一个已知的肝细胞因子[10]，是一种主要由肝脏合成分泌的急性期蛋白，在应激条件下（如组织损伤和炎症）显著升高，具有调控细胞外基质（ECM）、调节糖代谢、维持血管通透性等重要的生物学功能[10-12]。此外，ORM1在结肠腺癌细胞、肝细胞、免疫细胞等多种细胞上，表现出促进增殖的作用[13-15]。但ORM1调控肝细胞增殖的具体作用机制尚不完全明确，有待进一步研究。
为进一步探究ORM1在肝细胞增殖中的具体作用及机制，本研究首先在两种肝细胞系上验证了ORM1促进肝细胞增殖，并通过对ORM1敲除小鼠的肝脏组织测序，挖掘ORM1调控肝细胞增殖的可能机制。本研究旨在揭示ORM1促进肝细胞增殖的潜在功能和机制，为肝脏损伤修复及相关疾病的治疗提供新的分子靶点和理论依据。
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α1-酸性糖蛋白（美国 Sigma-Aldrich 公司）、CCK8试剂盒（Adamas life）、Lipofectamine 3000试剂（Thermo Fisher Scientific）。
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小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，购自中国科学院细胞库。培养液配方：DMEM、10%FBS、1%双抗生素。培养条件：5%CO2、37 ℃恒温孵育箱。人肝癌细胞系HepG2，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。培养液配方：MEM（含NEAA）、10%FBS、1%双抗生素。培养条件：5%CO2、37 ℃恒温孵育箱。
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细胞接种于96孔板，密度约104/孔，每组复孔为9；ORM1过表达、干扰或人源ORM给药（10、50、100 μg/ml）处理相应时间后，弃去培养基，在细胞贴壁后，使用无血清培养基处理细胞，培养相应时间后，加入CCK8试剂，吸光度测定（Epoch BioTeK酶标检测仪）450 nm处的A值，根据不同组之间的A值计算组间差异。
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通过LipofectamineTM
3000 将ORM1过表达质粒（序列见NM_008768.2）或siRNA转染进细胞内，以实现过表达或干扰目标基因的目的。当细胞密度达到50%～70%时，进行过表达质粒的瞬时转染实验；当细胞密度达到30%～50%时，进行siRNA的瞬时转染实验。吸取舍弃原培养基后用1×PBS轻柔洗涤细胞1~2次，根据转染条件配制好转染试剂，随后将配置好含有过表达质粒（或siRNA）的DMEM培养基加入至细胞培养基中用于细胞继续培养，最后置于细胞培养箱中孵育24 h（若为转染siRNA，则孵育48 h）即可完成细胞瞬时转染试验。siRNA序列及转染试剂配制方法见表1、表2。siRNA名称 siRNA序列（5'→3'） si-ORM1 CCACCAACUUGAUAAACGATT 培养皿 Opti-MEM （μl） Lipo3000 （μl） DNA转染 RNA转染 DNA （ng） P3000 （μl） RNA （pmol） 96孔板 2×10 0.3 100 0.2 20 -
使用ORM1基因敲除（KO）小鼠和对应的野生型（WT）小鼠（均为C57BL/6背景，n=6）。在小鼠24周龄时采集肝脏组织，液氮速冻并存储于−80°C。RNA-seq委托上海欧易生物公司进行，差异基因分析通过DESeq完成，筛选标准为FoldChange>1.5或<0.66，且P<0.05。
差异基因富集分析通过DAVID进行，进行Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG）富集分析。KEGG分析用于揭示差异基因在代谢通路中的富集情况。富集分析筛选标准为P<0.05。
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实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计与分析。单因素两组之间相互比较，采用双尾非配对t检验（Student’t）检验分析；单因素多组之间相互比较，采用单向方差分析（One-way ANOVA）检验，组间均值两两比较采用Dunnett's multiple comparisons test。实验结果均采用“均数±标准误（Mean±SE）”表示。以P<0.05认为差异具有统计学意义。
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肝脏组织在肝切除术后会进入肝细胞快速增殖状态[16]。通过检索GEO数据库，选取C57BL/6小鼠在2/3肝脏部分切除术（PH）后数据（GSE43687）进行分析。结果显示，肝脏组织中ORM1的表达在PH后1.5 h时无显著变化，在PH后12 h显著上升（图1）。这一结果提示ORM1可能参与肝脏再生过程。
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为验证ORM1对肝细胞增殖的影响，我们在小鼠和人的肝细胞系上进行了ORM1过表达、干扰或ORM外源性给药实验。在小鼠Hepa1-6肝癌细胞系过表达ORM1（pCMV-ORM1），与对照质粒组（pCMV）组相比，转染后第3、4天ORM1过表达质粒组的细胞增殖显著增加（图2A）。而干扰ORM1后细胞增殖能力呈现相反的结果（图2B）。人HepG2肝细胞上给予不同浓度外源性ORM，48 h后检测细胞增殖情况，可见随着ORM1浓度的增加，细胞增殖呈现显著上升（图2C）。上述结果表明ORM1对肝细胞增殖具有显著的促进作用。
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为了进一步探究ORM1基因敲除后对肝脏组织的影响，我们对ORM1基因敲除（KO）小鼠和野生型（WT）小鼠的肝脏组织进行了测序。KEGG富集分析表明，在ORM1基因敲除小鼠与野生型小鼠的比较中，差异表达基因被富集在“细胞生长与死亡”和“细胞运输与自噬”等通路中（图3A），提示ORM1缺失会引起细胞生长和死亡相关的通路相关改变。
进一步信号通路的富集分析显示，PI3K-Akt、MAPK、PPAR、Hippo、Jak-Stat等通路在差异基因表达分析中有显著富集（图3B），其中，PI3K-Akt、MAPK、Hippo、Jak-Stat通路据报道与细胞增殖高度相关[17-19]。这些结果提示，ORM1基因敲除可能影响细胞增殖关键通路，通过调控细胞生长、死亡相关的基因影响肝细胞增殖。
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为进一步明确ORM1在这些经典通路中的调控机制，我们重点分析了其中与细胞增殖相关的差异基因表达变化。在PI3K-Akt信号通路中，具有促增殖作用的Itgb8和Ntf3显著下调（图4A）。在MAPK信号通路中，同样具有促增殖作用的Map3k6在KO组中显著下调，而抑制细胞增殖作用的Gadd45a则显著上调，Hspa1b和Hspa2下调（图4B）。与之类似，Jak-Stat信号通路中的Il6ra和Lepr具有促增殖作用，其表达在KO组中也显著下调，而有抑制细胞增殖作用的Cish在KO组中的表达显著上调（图4C）。在Hippo信号通路中，具有促增殖作用的Tef7、Tead1、Ctgf在KO组中的表达显著下调（图4D）。这些结果表明，ORM1可能调控PI3K-Akt、MAPK、Jak-Stat和Hippo信号通路中的影响细胞增殖的多种关键信号分子影响肝细胞的增殖。
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本研究中，我们揭示了ORM1在肝细胞增殖中的潜在调控机制。首先，利用GEO数据库（GSE43687）分析，发现ORM1在小鼠2/3肝切除术后12h表达升高，提示ORM1可能参与肝脏再生。而在体外肝细胞系中，过表达ORM1或外源性给药ORM，可以促进肝细胞增殖；相反，干扰ORM1抑制的肝细胞的增殖，进一步验证了ORM1对肝细胞增殖的促进作用。此外，我们对ORM1基因敲除小鼠组学分析，发现PI3K-Akt、MAPK、Hippo、Jak-Stat等细胞增殖相关通路的多个信号分子在ORM1缺失时表现出显著变化，提示这些关键通路可能参与了ORM1对肝细胞增殖的调控。
在PI3K-AKT信号通路中，Ntf3（neurotrophin-3）主要通过与受体TrkC结合，促进细胞的存活、增殖和分化[20]。ORM1缺失后Ntf3的下调可能导致细胞存活和再生能力减弱。而Itgb8（整合素β8）和Lamc2（laminin subunit gamma-2）作用类似，均是通过与细胞外基质（ECM）蛋白（如纤连蛋白、胶原蛋白等）结合，介导细胞与其周围环境的相互作用，从而影响细胞的增殖和分化[21-22]。ORM1缺失后，Itgb8和Lamc2下调提示ECM重塑减弱，从而无法为新生肝细胞的重新附着与生长提供必要的微环境支持。
在MAPK信号通路中，Gadd45a（growth arrest and DNA damage-inducible alpha）是一种生长停滞和DNA损伤诱导因子，通过抑制细胞周期相关激酶（如CDK1和CDK2），阻止细胞从G1期或G2/M期进入下个阶段[23]。ORM1缺失后Gadd45a上调提示可能出现细胞周期停滞，从而抑制了肝细胞的增殖。Map3k6（mitogen-activated protein kinase 6）作为一种激酶，通过磷酸化MAPK激酶调控下游的信号分子和后续的细胞生物学反应，如细胞增殖、分化、存活、迁移和应激反应[24]。ORM1缺失后Map3k6下调可能导致MAPK通路激活减少。Hspa1b和Hspa2是热休克蛋白，在抑制凋亡通路主要通过抑制线粒体凋亡途径，caspase的活化以及调控JNK信号通路发挥作用；同时，Hspa1b和Hspa2通过清除活性氧（ROS）和稳定线粒体功能，发挥抗氧化应激损伤的作用，进而增加细胞存活。Hspa1b和Hspa2的下调提示ORM1缺失可能削弱细胞的抗氧化应激能力，从而影响肝细胞存活[26]。
此外，Jak-Stat3信号通路激活通过诱导与细胞增殖和抗凋亡相关的基因表达，如Cyclin D1和Bcl-2，从而促进细胞增殖、存活和组织修复[27]。而Cish（cytokine-inducible SH2-containing protein）是该通路一个重要的负反馈调节因子，通过抑制Jak-Stat信号的活化，调控细胞因子信号传导的强度和持续时间，发挥抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用[28]。与之相反，Il6ra是IL-6受体的亚基，IL-6结合IL-6受体后激活Jak-Stat3信号通路，诱导与细胞存活、增殖和组织修复相关基因的表达[29]。此外，Lepr（leptin receptor）是瘦素（leptin）的主要受体，该受体激活后亦可激活下游Jak-Stat3信号通路[27]。特别是在肝脏中，Lepr信号能够促进肝细胞的再生和修复能力[30]。而ORM1敲除时，Cish上调，Il6ra、Lepr下调均表明JAK-STAT通路激活减少，从而导致细胞增殖减弱。
最后，在Hippo信号通路中，Tcf7在Hippo信号通路中扮演着重要的角色，其与细胞增殖的关系主要通过YAP/TAZ的激活来实现，并参与促进细胞增殖[31]，Ctgf是一种与细胞外基质（ECM）相关的结合肝素的蛋白，能够直接与整合素结合。它由成纤维细胞合成，并能促进细胞的增殖和趋化[32]，ORM1敲除导致Hippo通路中Tcf7和Ctgf表达下调，可能通过解除其对肝细胞增殖的抑制作用而促进细胞增殖。ORM1缺失还导致了该通路Tead1基因的下调，而Tead1作为YAP（yes-associated protein）和TAZ的下游效应器，与YAP/TAZ结合后在细胞核中调控靶基因Birc5、Cyr61、CTGF和Myc等的表达，进而促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，并推动组织生长和再生[33]。
本研究阐释了ORM1可能通过调控PI3K-Akt、MAPK、Hippo、Jak-Stat等信号通路发挥促进肝细胞增殖的作用。提示ORM1可能通过影响肝细胞存活、ECM重塑等一系列复杂机制调节肝细胞增殖过程。未来研究应进一步探讨ORM1在这些信号通路中的具体调控机制，特别是在不同病理条件下如何影响肝细胞的增殖、凋亡以及组织修复，为肝脏疾病的治疗提供新的潜在靶点。
Exploration of the role and mechanism of ORM1 in promoting hepatocyte proliferation
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410014
- Received Date: 2024-10-14
- Rev Recd Date: 2025-02-25
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Key words:
- ORM1 /
- hepatocyte proliferation /
- mechanism of action /
- signaling pathway
Abstract:
| Citation: | YANG Jinrun, LI Xiang, SUN Yang. Exploration of the role and mechanism of ORM1 in promoting hepatocyte proliferation[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202410014
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