Quorum-sensing inhibition of flavonoid glycosides from Epimedium brevicornum

超声细胞破碎仪，宁波新芝JY99-IIDN，中国；低温高速离心机，贝克曼Avanti J-26S XP，美国；高压灭菌锅，SANYO MLS-3020，日本；真空干燥箱，上海一恒科技有限公司DHG-9053A，中国；酶标仪，TECAN infinite M200 pro，瑞士；旋转蒸发仪，BUCHI Rotavator R-200，瑞士；光学显微镜，尼康80i，日本。

化学试剂乙醇（批号XW00641751），二甲基亚砜DMSO（批号XW00676851）购自国药集团化学试剂有限公司；本实验中所用的抗生素包括妥布霉素（批号014241281）、硫酸奈替米星（批号014138073）、庆大霉素（批号014321472）、环丙沙星（批号014252858）、淫羊藿苷（批号01230870）宝藿苷（批号014125028）、朝藿定A（批号045930800）、朝藿定B（批号045930801）、朝藿定C（批号041603427）等，对照品水杨酸（批号013474062）自上海泰坦科技股份有限公司购买得到；几丁质酶活性检测试剂盒（批号BC0825）购自北京索莱宝公司；LB培养基（批号041417503）自上海泰坦科技股份有限公司购买得到；淫羊藿购自湖北十堰丹江口铜架山村毛家坪淫羊藿种植基地，由海军军医大学中药鉴定学教研室张成中副教授鉴定；紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1均由广东省微生物菌种保藏中心购买，菌种均于−80 °C冰箱冻存。

淫羊藿药材50 °C烘干，粉碎，过40目筛，保存备用。称取5.0 g淫羊藿粉末，加入100 ml 75% 乙醇，超声破碎30 min，过夜静置，过滤取上清，上清液减压浓缩至浸膏。溶于1% DMSO溶液中，过滤，分装，−20°C保存备用。淫羊藿提取物的质量浓度为 0.5 mg/ml。

将淫羊藿苷、宝藿苷、朝藿定A/B/C、水杨酸分别称取2.00 mg 溶于1 ml DMSO溶液（1%）中，得到浓度为2 000 μg/ml的标准品母液，−20°C保存备用。将抗生素妥布霉素、硫酸奈替米星、庆大霉素、环丙沙星溶于1 ml DMSO溶液（1%）中，得到浓度为100 μg/ml的标准品母液，−20°C保存备用。

菌株活化后按1%接种量接种于现配LB培养基，37 °C，220 r/min震荡培养至OD_600nm为0.4～0.6。加入上述制备的样品，采用2倍稀释法梯度稀释，DMSO为阴性对照，在2、4、6、8、10 h分别测定OD_620nm值，实验进行3个重复，测定最小抑菌浓度。

按1.4实验结果，本实验按200 μg/ml以下浓度进行，制备不同浓度样品（最终浓度分别为25、50、100 μg/ml）的CV026菌液，加入C6-HSL终浓度为5 μmol/L，28°C培养24 h。DMSO为阴性对照。取3 ml培养液，12 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入1 ml 酸化乙醇（4%，1 mol/L HCl），充分混匀，离心，取上清液，534 nm处测定吸光值^[14]。按下式计算抑制率^[15]：

将铜绿假单胞菌 PAO1培养物稀释至现配LB中，将样品（终浓度100 μg/ml）加入到实验组，并将DMSO作为阴性对照组，水杨酸作为阳性对照。将200 μl样品添加到96孔平板中，在37°C下温育24 h，除去悬浮培养物。利用光学显微镜观察后，用无菌磷酸盐缓冲盐水PBS（pH 7.2）洗涤，保持不破坏底部生物被膜。将200 μl的LB培养基和溶解有样品（终浓度100 μg/ml）或DMSO（阴性对照）或具有抗生素的LB培养基添加到96孔板中。适当摇动，将平板在37°C下再温育24 h。使用酶标仪在620 nm（OD₆₂₀）处测量光密度^[16]。

将铜绿假单胞菌 PAO1培养物稀释至现配LB中，将样品（终浓度100 μg/ml）加入到实验组，并将DMSO作为阴性对照组，水杨酸作为阳性对照。使用几丁质酶活性检测试剂盒，将1 ml的提取液加入到1 ml培养物中，10 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清液，分别沸水浴反应 10 min，置于冰上暂存。在540 nm下测定每管的吸光度，对比标准曲线计算几丁质酶活性^[17]。

根据紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的生长情况，以及测定培养物的OD值，确定淫羊藿提取物及活性成分对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的最小抑菌浓度如下表1。淫羊藿提取物及五种黄酮苷的MIC都在500 μg/ml。因此，后续实验测定选择200 μg/ml以下的浓度对于紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌PAO1生长均无抑制作用。

紫色杆菌群体感应的特殊现象就是产生紫色色素，对6个样品进行浓度梯度实验，样品对于CV026群体感应的抑制作用可以通过检测紫色色素的产生量进行判定。实验结果显示，淫羊藿提取物、淫羊藿苷和朝藿定C对CV026紫色色素的产生有抑制作用，且随着样品浓度升高而增强，淫羊藿苷和朝藿定C浓度达到100 μg/ml时，其抑制率可达到42.9%和31.9%，与阴性对照组（DMSO）相比有显著差异（P<0.05，图1）。结果表明，淫羊藿苷和朝藿定C在不影响CV026生长的情况下，具有良好的群体感应抑制作用。

生物被膜的产生是导致抗生素耐药的主要原因之一。铜绿假单胞菌能生成高度结构化和致密的生物被膜，多与群体感应有关。本实验利用光学显微镜对细胞爬片上的生物膜进行观察，利用酶标仪对其定量测定，结果如图2所示。淫羊藿苷与朝藿定C（100 μg/ml）均表现出优于阳性对照水杨酸的抑制活性，与阴性对照组（DMSO）相比有显著差异（P<0.05, P<0.01）。

几丁质酶是真菌和细菌生物被膜中的重要成分，是一种中药的毒力因子，能够帮助病原菌穿透组织侵袭宿主。本实验通过淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg/ml）对铜绿假单胞菌 PAO1培养物进行处理，结果表明淫羊藿提取物、淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg/ml）可大大降低几丁质酶活。几丁质酶活分别降低了41％、38％和45％（图3），与阴性对照组比较有显著差异（P <0.05，P <0.01，P <0.001）。

本实验利用群体感应抑制研究的模式菌株CV026紫色杆菌、PAO1铜绿假单胞菌对淫羊藿提取物及其主要的黄酮苷类成分进行了最小抑菌浓度MIC的测定，发现其在500 μg/ml浓度下不影响病原菌的正常生长，随后，分别对紫色色素、生物被膜、几丁质酶等毒力因子进行测定，发现淫羊藿苷、朝藿定C（100 μg /ml）对紫色杆菌CV026和铜绿假单胞菌 PAO1的群体感应具有抑制作用。

随着常见致病菌的耐药性的增多，通过抑制或沉默致病菌群体感应的方法被认为是解决耐药性的途径之一，本实验中涉及到的作为研究群体感应的模式菌株得到了大量的应用，在此基础上挖掘出大量具有潜力的QSI，例如绿茶中的茶多酚、西柚中的香豆素、百里香中的香芹酚以及白藜芦醇、山奈酚、槲皮素等^[9-11,18,19]。淫羊藿中的黄酮苷类成分与上述的潜力QSI有着结构上的相似性，因此我们推测可能是黄酮类的化合物结构与QS系统的信号分子相似，当其处于高浓度时可能会与QS系统中的某些信号分子受体产生竞争性结合，以此抢占活性受体靶标，阻断了QS系统传导，最终导致细菌毒力因子的表达下降。

黄酮苷类成分作为淫羊藿的主要活性成分，尤其是本实验中发现的淫羊藿苷和朝藿定C两个活性单体可以作为抗感染治疗的一种潜在前体，与上述潜力QSI有一定差异性，前者大多是以苷元的形式存在，其水溶性较差，而本文中提到的淫羊藿苷和朝藿定C分别带有二糖和三糖基修饰，其水溶性大大的增强，在进入生物体后，水解生成黄酮苷元发挥抑制作用，可能具有更高的生物利用度。