Effect of hypertension on cardiovascular fibrosis and sFRP2 expression

酶标仪、低温离心机（Thermal，美国）；水浴锅（上海力康医疗设备有限公司）；涡旋混匀器（大连竞迈生物科技有限公司）；倒置显微镜、石蜡包埋机、全自动组织脱水机、烤片机（徕卡，德国）。BCA蛋白浓度测定试剂盒、4%多聚甲醛、Tubulin抗体、山羊抗鼠IgG抗体（上海碧云天生物技术有限公司）；二甲苯（武汉赛维尔生物科技有限公司）；0.1M PBS、浓盐酸（国药集团化学试剂有限公司）；羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；H&E染色试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司）；天狼星红染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；地衣红弹力纤维染色试剂盒（北京博奥生物技术有限公司）；sFPR2抗体（Abcam，美国）。

28周龄SPF 级SHR和WKY大鼠，由必凯科翼生物科技有限公司提供，所有实验大鼠均饲养在独立通气笼盒（IVC）系统中，温度（24±2） ℃，相对湿度为 40%～60%，饲养期间笼盒内保持清洁，大鼠在笼内自由活动、进食及饮水，动物房内照明系统为自动控制（12 h照明、12 h黑暗）。动物实验标准均依照国家《实验动物护理使用卫生指南》，并经过海军军医大学医学研究伦理委员会批准，实验动物处置符合动物伦理学标准。

首先，称量并记录大鼠体重，在大鼠被深度麻醉并处于稳定状态后，进行开胸手术以暴露心脏，并通过灌流技术清除血液。接着，小心地取出心脏组织，使用精确的天平进行称重并计算心脏重量指数（CWI），计算公式CWI（mg/g）=心脏全重（mg）/体重（g）。

由于弹力纤维比较稳定能抵抗热碱的消化，而胶原纤维会在热碱中溶解，所以我们通过热碱法分离胶原纤维和弹力纤维，通过准确称量确定弹力纤维的含量。将主动脉组织样品在玻璃碾磨器中充分碾磨，充分碾磨后移到玻璃管中，加入PBS清洗两次样品。后加入dd H₂O，离心后去除上清。加入乙醇乙醚，室温静止2 h，去除样品中的脂类成分。离心后去上清。真空干燥。称重记录，并将重量调整到尽可能一致。样品放入有螺帽的离心管中。加入0.3%的SDS过夜，去除其中可溶性蛋白，后离心去除上清。加入 0.1M的NaOH,再次离心去除上清以减少残留的SDS。再次加入0.1M的NaOH，在沸水中煮15min×3次。静止冷却，离心后将上清吸入离心管中。加入0.5 ml热水洗两次，将上清移入另一离心管中。将沉淀和上清真空干燥两小时后冻干。冻干后对沉淀称重记录作为胶原的含量。对于上清中的冻干粉加6M的盐酸，97 ℃加热24 h后真空干燥。在盐酸裂解产物中加入1ml dd H₂O，5000×g离心5 min将上清移入另一离心管中。分离后得到的样品直接进行羟脯氨酸的测定。由于羟脯氨酸在胶原蛋白中占 13.4%，在弹性蛋白中占极少量，其它蛋白中均不存在。因此测定羟脯氨酸的量能反映组织的胶原纤维含量情况。具体实验方法参考羟脯氨酸测定试剂盒说明书。

大鼠取胸主动脉固定于4%多聚甲醛中，48小时后包埋成蜡块，用蜡块切片机将组织切成4 um厚的组织切片。H&E染色后进行胸主动脉形态学检测。天狼星红染色后测算胸主动脉壁胶原纤维容积分数（collagen volume fraction，CVF），CVF%=胶原纤维面积/视野组织总面积*100%，以评估血管纤维化。地衣红染色后测算胸主动脉壁弹力纤维容积分数（elastic fibers volume fraction），弹力纤维容积分数=弹力纤维面积/视野总面积×100%，以评估血管弹力纤维含量的变化。用倒置显微镜拍摄染色切片图像，利用ImageJ pro软件分析结果。

H&E染色、天狼猩红染色、地衣红染色流程：石蜡切片常规脱蜡至水，按照试剂盒说明书进行染色操作。电吹风吹干样片，自然晾干。

取适量心脏组织至2 ml高速离心管，加入蛋白裂解液后，使用高通量匀浆仪匀浆240s。取出高速离心管，离心（12000×g，20 min）。将上清液转移至另一干净 1.5 ml EP 管中，后进行蛋白浓度测定，剩余样品加入5×蛋白上样缓冲液，97 ℃变性10 min得到蛋白样品。

使用 10% SDS-PAGE 凝胶进行电泳，电泳条件为：150 V，60 min。使用 PVDF 膜进行转膜，转膜条件为 100 V，60 min。转膜结束后，使用快速封闭液封闭15 min，之后使用 1×TBST 缓冲液洗膜，5 min×3次。加入一抗（1∶1000 稀释）4 ℃ 孵育过夜。次日去除一抗孵育液，使用1×TBST 缓冲液洗膜，5 min×3次。加入二抗孵育液（1∶2000稀释）常温孵育1h，用1× TBST 缓冲液洗去二抗5 min×4 次，结束后即可进行扫膜。

实验所得数据采用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学处理。为了评估两组间的差异性，采用独立样本t检验（双尾）进行比较。设定显著性水平为0.05，即当P值小于0.05时，认为两组间的差异具有统计学意义。

SHR大鼠的平均体重（363.25±30.79）g，平均心脏重量（1.15±0.05）g，WKY大鼠平均体重（383.55±48.08）g，平均心脏重量（0.83±0.12）g，SHR组的 CWI较WKY组明显增加（^***P<0.001）（ 图1）。

观察心脏切片天狼猩红染色并利用ImageJ pro软件分析发现SHR组较WKY组胶原纤维增多，胶原纤维容积分数明显增加且差异有统计学意义（图2）。

对SHR组与WKY组大鼠的心脏组织进行sFRP2蛋白表达水平进行检测，两组大鼠在左、右心室的sFRP2蛋白表达水平上并无显著性差异（图3）。

在对28周龄自发性高血压大鼠（SHR组）与同龄的正常血压对照组大鼠（WKY组）的主动脉组织进行比较分析时，观察到SHR组的弹力纤维含量显著低于WKY组，而胶原纤维含量则呈现轻微升高的趋势，但并未达到统计学意义（P=0.0886）。此外，SHR组主动脉组织中胶原纤维与弹力纤维的比值较WKY组有显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05）（见表1）。

观察H&E切片，在200倍镜下测量主动脉厚度发现SHR组较WKY组主动脉管壁明显增厚且差异具有统计学意义（P<0.005），观察天狼猩红染色和地衣红染色切片并利用ImageJ pro软件分析发现SHR组较WKY组胶原纤维增多、纤维网结构疏松、弹力纤维含量减少。但胶原纤维面积占比与弹力纤维面积占比差异并无统计学意义（图4）。

心脏重构与心律失常、心力衰竭和猝死等密切相关，临床上，心脏重构主要表现为心腔扩大、心肌肥厚以及心脏收缩和舒张功能障碍，是心脏疾病进展至终末期的必经阶段^[9]。血管重构是内外环境的变化引起的血管结构异常改变，导致血管功能障碍^[6]。心脏和血管重构是高血压病及其并发症造成靶器官功能损害的病理生理学基础^[10-11]，明确高血压病所致的心脏和血管重构对于缓解高血压病病程发展以及预防高血压病所致的并发症具有重要意义^[12]。本研究发现，与对照组WKY大鼠相比，自发性高血压大鼠的心脏组织中胶原纤维含量明显增加，回顾既往研究，在心梗及心衰小鼠模型动物中，心脏组织胶原纤维含量增加伴随着sFRP2蛋白表达的增加^[8]，而我们通过蛋白免疫印迹实验发现两组大鼠心脏组织sFRP2蛋白表达水平并无差异，该结果提示，自发性高血压引起的心脏重构可能和sFRP2蛋白无关，而可能涉及其他纤维化相关蛋白的表达水平改变；回顾已有的研究，运用病理染色手段评估自发性高血压大鼠的主动脉组织中胶原含量增加具有统计学差异，而我们的研究并没有得到相同的结果。我们运用了热碱法分离主动脉组织中的胶原纤维和弹力纤维并对其进行定量分析，也没有得到和既往研究相同的结果，我们的研究显示在自发性高血压大鼠的主动脉组织中胶原纤维含量呈增加趋势，而弹力纤维含量呈减少趋势，综合既往的研究以及我们的研究结果，我们认为自发性高血压引起的主动脉组织重构可能不仅仅是胶原纤维和弹力纤维含量的简单变化，还可能影响胶原纤维和弹力纤维的交联方式，从而影响疾病的进程及其并发症的发生。未来的研究需要进一步探索这些潜在的重构机制，以期为高血压及其并发症的预防和治疗提供新的策略。