Study on the extraction, separation and purification process of actinoside E

Agilent 1200型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；2500Y多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；BT25S十万分之一电子天平（德国塞利多斯公司）；SYG-A2-6电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵（上海亚荣生化仪器厂）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DHG-9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；IS-RDV1恒温振荡器（苏州捷美电子有限公司）。

对萼猕猴桃苷E（纯度≥98%，自制）；无水乙醇、乙酸乙酯、甲醇为分析纯试剂（上海泰坦科技股份有限公司）；甲酸（上海麦克林生化科技股份有限公司）、乙腈（德国Merck公司）、甲醇（上海泰坦科技股份有限公司）为色谱纯试剂；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）；D101型、AB-8型、DM130型、HPD100型、NKA-9型大孔吸附树脂（北京瑞达恒辉科技发展有限公司）；柱层析硅胶（100~200目、200~300目，青岛海洋化工有限公司）；ODS填料（日本YMC公司）。

对萼猕猴桃叶样品为2008年5月采自浙江省衢州市常山县，经海军军医大学辛海量教授鉴定为猕猴桃科猕猴桃属植物对萼猕猴桃Actinidia valvata Dunn的叶。样品于60 ℃烘箱烘干，粉碎过三号筛，得对萼猕猴桃叶粉末，置干燥器中密封保存。

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm, 5 µm）；流动相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）（梯度洗脱：0~35 min, 10%~40% B）；流速：1 ml/min；柱温：26 ℃；检测波长：265 nm；进样量：10 µl。对照品及样品色谱图见图1。

精密称取对萼猕猴桃苷E对照品15.77 mg，置于10 ml容量瓶中，加色谱纯甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得浓度为1.577 mg/ml的对萼猕猴桃苷E对照品溶液，过0.45 µm微孔滤膜，备用。

精密称取对萼猕猴桃叶粉末2 g，置于250 ml圆底烧瓶中，加入55%乙醇50 ml，95 ℃回流提取1 h，过滤后滤液定容至50 ml，摇匀，经0.45 µm微孔滤膜过滤，备用。

（1）线性关系考察

精密吸取对萼猕猴桃苷E对照品溶液0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、5.0 ml，分别置于5 ml容量瓶中，色谱纯甲醇溶解定容，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定。以对萼猕猴桃苷E浓度（mg/ml）为横坐标（c），其峰面积（mAU*s）为纵坐标（A），绘制标准曲线。回归方程为A = 11127 c+31.985，R²=0.9998，表明对萼猕猴桃苷E在0.047~1.577 mg/ml范围内与其峰面积线性关系良好。

（2）精密度试验

精密吸取同一浓度的对萼猕猴桃苷E对照品溶液连续进样6次，记录其峰面积，相对标准偏差（RSD）为1.29%，表明仪器精密度良好。

（3）稳定性试验

精密称取对萼猕猴桃叶粉末2 g，按“2.1.3”项下方法进行制备，分别于室温0、4、8、12、16、24 h进样测定，记录峰面积，RSD为0.21%，表明供试品溶液在室温条件下24 h内稳定性良好。

（4）重复性试验

称取对萼猕猴桃叶粉末6份，每份2 g，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样测定并记录峰面积，RSD为1.07%，表明该方法重复性良好。

（5）加样回收率试验

精密称取已知对萼猕猴桃苷E含量的对萼猕猴桃叶粉末9份，每份1 g，分别加入相当于本底量80%、100%、120%的已知浓度的对萼猕猴桃苷E对照品溶液，按“2.1.3”项下方法进行制备，进样分析并计算加样回收率。对萼猕猴桃苷E的平均加样回收率为101.16%，RSD为1.95%，表明该方法准确可靠。

以对萼猕猴桃苷E的含量为指标，单因素考察乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度对对萼猕猴桃苷E含量的影响，并通过四因素三水平L₉（3⁴）正交试验优选对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺。

（1）乙醇浓度考察

精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1∶10分别加入45%、55%、65%、75%、85%、95%乙醇，90 ℃回流提取1 h，滤液定容至50 ml，测定对萼猕猴桃苷E含量。结果表明，对萼猕猴桃苷E的含量随乙醇浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，当乙醇浓度为65%时对萼猕猴桃苷E含量最大（图2A）。

（2）料液比考察

精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，分别按料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35加入65%乙醇，90 ℃回流提取1 h，滤液定容至相应体积。结果表明，料液比过大时，对萼猕猴桃苷E含量下降，其在料液比为1:25时含量最大（图2B）。

（3）提取时间考察

精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1:25加入65%乙醇，90 ℃回流提取1次，提取时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，滤液定容至125 ml。结果表明，对萼猕猴桃苷E含量在提取时间为1 h时最大（图2C）。

（4）提取温度考察

精密称取6份对萼猕猴桃叶粉末，每份5 g，按料液比1:25加入65%乙醇，分别于50、60、70、80、90、100 ℃回流提取1 h，滤液定容至125 ml。结果表明，对萼猕猴桃苷E含量随着提取温度的升高而不断增加，温度升高到90 ℃时，对萼猕猴桃苷E含量骤然提升，当提取温度为100 ℃时其含量最大（图2D）。

根据单因素实验考察结果，确定影响对萼猕猴桃苷E提取率的因素为乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、提取温度（D）4个因素，每个因素选取3个水平，设计L₉（3⁴）正交表进行正交试验，优化对萼猕猴桃苷E的提取工艺。重复试验正交结果及直观分析见表1，方差分析见表2，结果表明，影响对萼猕猴桃苷E含量的主次因素为提取温度>乙醇浓度>料液比>提取时间，其中提取温度和乙醇浓度有显著性差异（P < 0.05）。综合考虑，确定对萼猕猴桃苷E的最佳提取工艺为A₁B₂C₂D₂，即以对萼猕猴桃叶粉末25倍量的55%乙醇，95 ℃回流提取1 h。

根据优选出的提取方法制备3份对萼猕猴桃叶提取液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，所测对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取率为99.32%，得率为0.80%，RSD均小于1%，表明所选工艺稳定，可用于对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取。

（1）大孔树脂预处理

取5种型号的大孔树脂D101、AB-8、DM130、HPD100、NKA-9适量，置于250 ml锥形瓶内，倒入高于树脂层3 cm的95%乙醇，置摇床振摇12 h，继续用95%乙醇洗涤，直至洗涤液不浑浊。然后加入蒸馏水至摇床振摇清洗，直至无醇味。

（2）大孔树脂型号的筛选

精密称取已处理的上述树脂各0.5 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，分别加入最佳提取工艺制备的对萼猕猴桃叶浓缩提取液10 ml，盖紧瓶塞，置于恒温振荡器中振摇12 h（150 r/min），达到饱和吸附后过滤，收集未吸附溶液，测定未吸附液中对萼猕猴桃苷E的含量，计算各树脂的吸附率。将上述静态吸附过的树脂用吸水纸吸干溶液，各用10 ml 75%乙醇溶液解吸附，相同条件下振摇，收集解吸附液，测定溶液中对萼猕猴桃苷E的含量，计算各树脂的解吸附率。结果见表3，综合吸附和解吸附性能考虑，最终根据权重大小选择D101型大孔树脂进行后续实验。

（3）上样液浓度考察

称取5份已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，分别加入浓度为0.07、0.16、0.24、0.33、0.55 mg/ml的对萼猕猴桃叶提取液5 ml，完全吸附后加3 BV水除杂，3 BV 95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，对萼猕猴桃苷E的转移率随上样液浓度的增加而升高（图3A），当上样液浓度大于0.55 mg/ml时，其流动性变差，不予考虑，因此选择0.55 mg/ml作为合适的上样液浓度。

（4）吸附流速考察

称取3份已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液5 ml，分别以0.5、1、2 ml/min的流速上柱吸附，完全吸附后加3 BV水除杂，3 BV 95%乙醇洗脱，收集洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，吸附流速增大，对萼猕猴桃苷E的转移率下降（图3B），故选择0.5 ml/min作为合适的吸附流速。

（5）最大上样体积考察

称取已处理的D101大孔树脂20 g（1 BV=30 ml），湿法装柱，制备一定体积的浓度为0.55 mg/ml的上样液，吸附流速为0.5 ml/min，收集流出液（每15 ml收集1管），根据泄露曲线确定最大上样量。结果表明，当上样体积大于12 BV时，流出液中检测到对萼猕猴桃苷E，且泄露量逐渐增大（图3C），因此确定上样量为12 BV。

（6）梯度洗脱曲线考察

称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，完全吸附后，加水和10%、30%、50%、70%、95%乙醇各4 BV依次洗脱，收集各段洗脱液，每1 BV为1份。结果显示，水和10%乙醇洗脱液中有极少量的对萼猕猴桃苷E，其主要集中在30%和50%乙醇洗脱液中（图3D），故选择水和10%乙醇除杂，50%乙醇洗脱。

（7）除杂溶剂用量考察

称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，以0.5 ml/min的流速上样吸附，加水和10%乙醇除杂，均冲洗10 BV，按柱体积收集各段除杂液，将其烘干称重。结果表明，水和10%乙醇除杂液烘干质量均在第5 BV后无明显变化（图3E），因此除杂体积均控制在5 BV。

（8）洗脱溶剂用量考察

称取已处理的D101大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇洗脱10 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量。结果表明，7 BV后洗脱液中对萼猕猴桃苷E的量基本可以忽略（图3F），因此选择50%乙醇洗脱液的用量为7 BV。

（9）D101型大孔树脂柱纯化对萼猕猴桃苷E工艺验证

称取已处理的D101型大孔树脂20 g，湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，以0.5 ml/min的流速进行动态吸附，完全吸附后，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇7 BV洗脱，除杂和洗脱流速均为2 ml/min，收集洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量，计算该步骤中对萼猕猴桃苷E的转移率，并将洗脱液浓缩干燥至恒重，备用。结果表明，在大孔树脂纯化步骤中，对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的转移率为91.36%。该纯化工艺稳定可行，可用于对萼猕猴桃叶提取液的纯化。

（1）硅胶柱装填

称取200~300目硅胶适量，用初始比例的洗脱液充分溶胀后湿法装柱，尽可能地排出柱子中的气泡，待其沉降后加入洗脱液充分冲洗压实，直至硅胶层界面不再下降。收集D101型大孔树脂50%乙醇洗脱部分所得的干燥样品，适量甲醇溶解后与100~200目硅胶按质量比1∶1~1∶1.5于50 ℃水浴锅上充分混匀蒸干，干法上样后在其表面加一层空白硅胶，以不同比例的洗脱液洗脱，收集各段洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。

（2）不同洗脱系统的考察

①二氯甲烷-甲醇洗脱系统的考察：采用湿法装柱干法上样的方式进行硅胶柱色谱，依次用二氯甲烷-甲醇15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1洗脱，每个梯度洗脱5 BV，收集各段洗脱液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。结果表明，对萼猕猴桃苷E主要集中在10∶1和8∶1洗脱部位（图4A），可选择二氯甲烷-甲醇8∶1洗脱5 BV进行硅胶柱色谱。

②乙酸乙酯-乙醇洗脱系统的考察：依次用乙酸乙酯-乙醇20∶1、15∶1、10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶5、0∶1洗脱，其余步骤同上。结果显示，对萼猕猴桃苷E在10∶1条件下基本已完全洗脱（图4B），因此可选择乙酸乙酯-乙醇洗脱系统10∶1洗脱5 BV。

在硅胶柱色谱实验中，使用上述两种洗脱体系所得对萼猕猴桃苷E的转移率分别为82.09%、83.21%，两者相差不大，考虑到洗脱溶剂的毒性安全性问题，选择乙酸乙酯-乙醇系统作为硅胶柱色谱步骤的洗脱体系。

（3）硅胶柱纯化对萼猕猴桃苷E工艺验证

硅胶柱色谱采用湿法装柱干法上样的方式进行操作，上样后以乙酸乙酯-乙醇10∶1洗脱5 BV，收集洗脱液，测定洗脱液中对萼猕猴桃苷E的含量，得该步骤对萼猕猴桃苷E的转移率为83.52%。

将浸泡在甲醇中的ODS填料倒入色谱柱中，待其沉降完全后以初始洗脱比例30%甲醇溶液置换柱子中的纯甲醇溶液。将硅胶柱色谱所得的洗脱液浓缩干燥后用少量甲醇溶解过滤膜后进行湿法上样，待样品完全吸附后，依次用30%、40%、50%甲醇各洗脱2 BV，分段收集50%甲醇洗脱部分，通过液相色谱结果进行合并，合并液再次以相同条件进行ODS柱色谱，最终得到较纯的对萼猕猴桃苷E单体化合物（图5），该步骤中对萼猕猴桃苷E的转移率为70.37%，其纯度为99.9%，表明该方法分离纯化效果较好。

按照优选的对萼猕猴桃苷E提取分离纯化方法对其工艺进行验证。称取对萼猕猴桃叶粉末25 g，以25倍量55%乙醇95 ℃回流提取1 h，滤液减压浓缩。将已处理的D101型大孔树脂进行湿法装柱，量取浓度为0.55 mg/ml的上样液12 BV，吸附流速为0.5 ml/min，依次加水和10%乙醇各5 BV除杂，50%乙醇7 BV洗脱，洗脱液浓缩干燥。硅胶柱采用湿法装柱干法上样的方式进行柱色谱，上样后以乙酸乙酯-乙醇10:1洗脱5 BV，收集并浓缩干燥洗脱液。ODS柱经上样后依次用30%、40%、50%甲醇各洗脱2 BV，分段收集50%甲醇洗脱部分，较纯部分合并后再次以相同条件进行ODS柱色谱，最终得到黄色粉末状物质，HPLC进样检测，与对照品比对后确定该物质为对萼猕猴桃苷E。该提取分离纯化工艺所得对萼猕猴桃苷E的转移率为53.70%，得率为0.35%，纯度为99.9%，表明该方法稳定可行，可用于对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E的提取分离纯化。

中药的提取方法包括热回流提取、水煎煮提取、超声辅助提取等方法^[8]，在前期提取方法及提取试剂的考察中，我们使用了水及不同浓度的乙醇考察提取溶剂对对萼猕猴桃叶中对萼猕猴桃苷E提取率的影响，结果表明，乙醇浓度在60%左右时其提取率最大。此外，通过对超声提取法、热回流提取法及渗漉法三种提取方法的比较，发现热回流提取法具有时间较短、节省溶剂、提取率较大的优势，因此在本实验中选用乙醇回流提取法进行单因素考察和正交试验。

在回流提取实验的单因素考察中，除了乙醇浓度、料液比、提取时间和提取温度外，提取次数也是一个重要的考察因素。本实验发现，第2次回流提取所得的提取液中对萼猕猴桃苷E含量极低，基本可以忽略，因此在实验中确定提取次数为1次。

大孔吸附树脂柱色谱是分离纯化黄酮类化合物常用的方法之一^[9]，其吸附与解吸附性能对化合物的转移率有很大影响。本实验中，我们对D101型大孔树脂进行静态吸附与解吸附动力学考察，分别在不同时间点吸取未吸附液及解吸附液，测定对萼猕猴桃苷E的含量。结果显示，D101型大孔树脂属于慢速吸附型树脂，在上样时，应尽量降低流速，增加样品与树脂的接触时间，其解吸附能力较强，洗脱时可加大流速。

葡聚糖凝胶柱和ODS柱常作为化合物精制纯化的关键一步。前者主要是依据分子筛原理，由于化合物的分子量不同，在凝胶柱中受到的阻滞作用也不同，导致分子量大的化合物先被洗脱下来^[10]；后者是根据化合物极性的不同进行分离的，由于反相柱中固定相极性小于流动相极性，致使极性较大的化合物先从柱中流出。在硅胶柱色谱后，我们发现对萼猕猴桃叶洗脱液中主要成分为两个黄酮苷类化合物，两者结构式仅有一个乙酰基之差，使用葡聚糖凝胶柱始终无法完全分离。其中对萼猕猴桃苷E的极性与另一黄酮类化合物相比极性较小，通过高效液相色谱可以将两个化合物分离，且分离度较好。因此，选用ODS反相柱进行纯化，最终得到对萼猕猴桃苷E单体化合物。

本实验从中药资源非药用部位的开发利用角度出发，对对萼猕猴桃叶进行研究，首次设计出一条稳定可行、重复性好的提取分离纯化工艺从对萼猕猴桃叶中分离得到对萼猕猴桃苷E，整个工艺操作简易，提取效率高，所得对萼猕猴桃苷E纯度为99.9%。作为一个新化合物，其药物开发过程有很长的路要走，本实验所做的提取分离纯化工艺研究为对萼猕猴桃苷E进一步的药代动力学研究、安全性药理研究等内容的实施奠定了物质基础。