-
结直肠癌（CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤，在中国的发病率仅次于肺癌，且呈现逐年升高的趋势[1]。结直肠癌的发病机制具有多因素、多阶段、多基因突变等特点[2,3]。结直肠癌早期发现的概率低，多数患者出现明显症状后才被确诊，此时手术通常已无法完全控制肿瘤进展，需化疗控制病情[4]。结直肠癌患者最常用的化疗药物为奥沙利铂和五氟尿嘧啶（5-FU），分别是DNA合成抑制剂和胸苷酸合成酶抑制剂，影响细胞DNA复制和转录，最终导致细胞死亡[5-7]。近年来，复发/难治性结直肠癌患者逐渐升高，对多数化疗药无应答，其5年生存率低于10%[8-9]。结直肠癌患者耐药情况越来越严重，解决耐药问题的首要条件为阐明结直肠癌患者化疗耐药的机制。
随着人们对肠道微生物研究的深入，已明确表明其与多种肠道疾病相关，其中具核梭杆菌（Fn）与结直肠癌发生发展的关系研究最透彻[10-13]。在口腔、胃肠道、呼吸道等环境内均明确发现Fn，其是一种专性厌氧性、G−菌，可黏附、侵入细胞，获得适合生存的环境[14-16]。Fn可以产生毒力因子、提升白介素17（IL-17）和肿瘤坏死因子（TNF）等促炎因子水平、抑制自然杀伤细胞的细胞毒活性、招募肿瘤浸润性骨髓细胞等，促进肿瘤发生发展和耐药机制的产生[11-13, 17-19]。例如，Fn促进了CRC的进展，并使奥沙利铂和5-FU化疗耐药[20]，因此，解决Fn高富集后促进CRC进展并产生化疗耐药的问题，有望提升结直肠癌患者化疗的有效率。
本研究首先在类器官层面验证Fn促结直肠癌增殖作用，其次比较考察前期筛选获得的抗Fn化合物在Fn与结肠癌HCT116细胞共孵育条件下对其体外抗癌活性的影响，最后优选高活性化合物开展其对Fn灌胃干预下裸鼠结肠癌HCT116移植瘤抗癌药效评价，从而为新型抗结直肠癌药物研发提供先导化合物。
-
本研究所用活性化合物购自上海陶术生物科技有限公司；布氏肉汤、脑心浸出液（BHI）肉汤购自美国BD公司；结直肠癌类器官基础培养基、培养基补充液B、培养基补充液C、类器官培养型基质胶、肿瘤组织消化液和红细胞裂解液购自伯桢生物科技公司；直肠癌组织取自海军军医大学第一附属医院肛肠科；DMEM培养基、CCK-8检测试剂盒、胎牛血清购自上海翌圣生物科技股份有限公司；人结直肠癌细胞HCT116购自上海中国科学院细胞中心；具核梭杆菌（ATCC 23726）购自美国模式菌种收集中心；裸鼠购自上海吉辉实验动物饲养有限公司。xCELLigence RTCA DP实时无标记细胞分析仪（安捷伦科技有限公司）
-
①实验前准备：首先，配置完全培养基（结直肠癌类器官基础培养基∶培养基补充B∶培养基补充C=976∶20∶4），其次，将-20°C保存的类器官基质胶放置于4 °C融化（室温下不超过30 s），最后，将肿瘤组织消化液置于37 °C的水浴锅内预热；②组织收集与处理：直肠癌组织用类器官基础培养基清洗2遍，置于盛有PBS的无菌培养皿中，无菌剪刀剪碎组织至直径小于1 mm，然后用适量的肿瘤组织消化液重悬，并转移至离心管内，于37 ℃、100 r/min的恒温振荡培养箱中消化30 min，在消化完成的组织悬液中加入胎牛血清（FBS）至终浓度达1%～5%，减缓消化作用，同时轻轻吹打5～10次；③筛选细胞：用100 μm细胞过滤器过滤组织悬液，将穿过的滤液转移至离心管中，450 r/min离心3 min，吸去上清液；④细胞收集：用类器官基础培养基清洗细胞2次，加入红细胞裂解液裂解1 min，300 r/min离心3 min，吸去上清液；⑤3D培养板细胞接种：按每孔2×103个细胞用20 μl基质胶于冰浴条件下混匀，然后用移液器将基质胶和细胞的混合液移至细胞培养24孔板底部中央位置，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育15 min；⑥加液培养：待培养24孔板基质胶凝固至不再流动后，沿孔壁缓缓加入完全培养基，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；⑦加Fn菌液：培养72 h后，观察类器官成型且稳定，采用完全培养基重悬Fn使其浓度分别为1×108 CFU/ml和1×104 CFU/ml，加入24孔板中，同时在不同孔中加入同体积PBS；⑧观察：每天在同一视野、同一放大倍数下分别对PBS、浓度为1×104 CFU/ml和1 × 108 CFU/ml的Fn作用下的直肠癌类器官进行拍照记录，观察类器官生长变化，共4 d。
-
①细胞培养：用8 ml含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基培养HCT116细胞。待细胞生长至 90% 左右时，弃上清液，加入2 ml PBS清洗，2 ml胰酶消化1.0 min，加入3 ml含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基吹打均匀，1 000 r/min离心5 min后，弃去上清液，加入4 ml含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基再次吹打均匀，取10 μl细胞悬液稀释10倍至100 μl，置于细胞计数板上计数；②细胞铺板：将HCT116细胞按照浓度为每孔7 × 103个/ml加100 μl于96孔板中，37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育12 h；③受试药物与细胞或与细胞和Fn共孵育：吸出培养基，每孔加入100 μl不同浓度的受试化合物，将生长良好的Fn培养液用4 000 r/min离心10 min，弃上清液，加入无胎牛血清、无双抗的DMEM培养基混匀，比浊仪将菌的浓度调至0.5麦氏浊度[（1～2）×108 CFU/ml]制得Fn菌液，然后再加入100 μl感染系数（MOI）为1 000:1的上述Fn菌液或新鲜无胎牛血清和双抗的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养72 h；④测定IC50：吸出培养基，加入100 μl浓度为10%的CCK-8溶液，35 ℃孵育0.5 h，在450 nm波长的条件下读取A值；用GraphPad Prism 7软件拟合出受试药物对HCT116细胞或与Fn共孵育HCT116细胞的IC50值。
-
①HCT116细胞培养和Fn菌液准备同“2.2”项；②按实时无标记细胞分析仪的规范操作程序完成名称、目的、分组、时长等输入；③以50 μl含5%胎牛血清、无双抗DMEM培养基进行基线矫正；④每孔加入7×103个/ml 的HCT116细胞，在室温下放置 30 min后，放置于测试台中；⑤ 18 h后暂停设备，吸出培养基，加入含5%胎牛血清、无双抗DMEM培养基的Fn菌液100 μl，使得MOI=1 000∶1，加入浓度在最小抑菌浓度（MIC）上下的受试化合物100 μl，放入测试台中继续培养72 h，实时观察记录HCT116细胞数量变化。
-
①裸鼠在动物房无操作下饲养5 d，然后在裸鼠饮用水中加入链霉素和克林霉素使其浓度分别为5 g/L和0.1 g/L，继续饲养7 d以清理裸鼠肠道微生物，减少其他微生物对实验结果的影响；②以皮下注射方式，接种浓度为1.0×107个/ml的人源HCT116细胞；③待皮下肿瘤大小长至50 mm3时，将浓度为1×108 CFU/ml（BHI溶解）的Fn菌液灌胃，每2 d给予1次，500 μl/只，共4次；④将荷瘤裸鼠随机分为4组，对照组和PD-1组每组5只，甲氨蝶呤组和联合用药组每组3只。对照组：每3 d给予Fn灌胃1次；PD-1组：除每3 dFn灌胃1次外，另外给予PD-1腹腔注射100 μl，首周3次，次周2次，每次给药剂量为5 mg/kg；受试药物组：除给予每3 d予Fn灌胃1次外，再给予甲氨蝶呤灌胃500 μl，给药剂量为0.5 mg/kg，每天给药1次；联合用药组：采用同样的给药频率和给药剂量，同时给予甲氨蝶呤和PD-1；⑤裸鼠体重和肿瘤体积监测：每天监测荷瘤裸鼠体重和皮下肿瘤体积变化，观测15 d后断颈处死裸鼠。肿瘤体积计算公式为V=1/2×a×b2；式中a为肿瘤长径，b为肿瘤短径b。抑瘤率（%）=（对照组平均体积-实验组平均体积）／对照组平均体积× 100％。
-
实验处理及统计图表的绘制利用GraphPad Prism软件完成。符合正态分布计量资料用（
$ \bar{x}\pm \mathrm{s} $ ）描述，进行方差分析或t检验，计数资料采用$ {\chi ^2} $ 检验。P<0.05为有统计学差异。 -
连续4 d对PBS和不同浓度Fn干预下的固定位置直肠癌类器官生长情况的拍照观察结果显示，PBS阴性对照组的直肠癌类器官随时间呈缓慢生长；但是，1×104 CFU/ml浓度的Fn干预下的直肠癌类器官随时间呈急速生长，且呈浓度依赖（图1）。
-
用CCK-8法分别比较测定了前期筛选获得的9个MIC达2.0~32 μg/ml的抗Fn活性化合物对人结直肠癌HCT116细胞及在最优MOI条件下与Fn共孵育的人结直肠癌HCT116细胞的体外IC50，结果显示，9个受试化合物均能显著提升Fn与结肠癌细胞共孵育条件下的体外抗肿瘤活性，其中，甲氨蝶呤提升幅度最大，达143倍（表1）。
名称 MIC
（μg/ml）HCT116
（IC50，μmol/L）HCT116 + Fn
（IC50，μmol/L）新鱼腥草素钠 32 0.48 0.12 对甲氧基苯甲醛 32 4.22 1.77 PA-824 32 9.62 5.62 甲氨蝶呤 32 4.30 0.03 吲哚-3-甲酸 16 8.86 2.72 己烯雌酚 32 23.10 9.35 2'-脱氧胞嘧啶核苷 8 0.78 0.07 5-硝基-8-羟基喹啉 2 22.85 3.93 特地唑胺 2 4.29 1.42 通过实时无标记肿瘤细胞分析技术检测了优选抗Fn活性化合物甲氨蝶呤在Fn与HCT116细胞共孵育条件下对肿瘤细胞生长的影响，实时检测结果显示，甲氨蝶呤也能显著抑制Fn的促肿瘤细胞生长作用，且呈浓度依赖性（图2）。
综上所述，优选甲氨蝶呤开展后续Fn灌胃干预下裸鼠人结肠癌HCT116移植瘤的体内抗癌药效评价。
-
在Fn灌胃干预下，抗Fn优选化合物甲氨蝶呤（0.5 mg/kg）以及PD-1（5.0 mg/kg）单独用药的抑瘤率分别为11.39%、53.95%；当甲氨蝶呤（0.5 mg/kg）与PD-1（5.0 mg/kg）联用后，其抑瘤率可显著提升至67.46%（表2和图3B）。给药组荷瘤裸鼠的体重无显著变化，与对照组相似（图3A）。
组别 PD-1 甲氨蝶呤 单独用药 53.95% 11.39% 联合PD-1 − 67.46% $ {\chi ^2} $ − 65.82 P − <0.01 
-
本文研究表明：首先，Fn（1 × 104 CFU/ml）可显著促进直肠癌类器官增殖，且呈浓度依赖（图1）；其次，9个抗Fn活性化合物（MIC= 2.0~32 μg/ml）均能显著提升与Fn共孵育结肠癌HCT116细胞的体外抗肿瘤活性，其中，甲氨蝶呤提升抗癌活性幅度最大，达143倍（表1），同时，实时无标记肿瘤细胞生长分析实验显示，甲氨蝶呤也能显著抑制Fn促结肠癌HCT116细胞生长作用，且呈浓度依赖特性（图2）；最后，抗Fn优选活性化合物甲氨蝶呤（0.5 mg/kg）与PD-1（5.0 mg/kg）联用，对Fn灌胃干预下裸鼠人结肠癌HCT116移植瘤具有显著的抑制活性，其抑瘤率达67.46%，分别优于相同给药剂量的甲氨蝶呤和PD-1单独用药的抑瘤活性（表2和图3B），且对荷瘤裸鼠的体重无显著影响（图3A）。
总之，本研究可为后续抗Fn类抗结直肠癌药物结构衍生提供先导化合物，并有望拓展甲氨蝶呤的新适应证。同时，本文研究仍有部分缺陷，如体内实验没有设置无Fn灌胃干预组，观察无Fn干预情况下裸鼠移植瘤的肿瘤增殖情况，因此，这也为后续深入结构优化所得高抗Fn活性化合物的体内抗结直肠癌活性研究提供改进策略。
Screening of small molecule inhibitors against Fusobacteriumnucleatum and study of their anti-colorectal activity
doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405009
- Received Date: 2024-05-08
- Rev Recd Date: 2024-05-21
-
Key words:
- Fusobacterium nucleatum /
- phenotypic screening /
- anti-crc /
- organoids /
- methotrexate
Abstract:
| Citation: | BAI Xuexin, CHEN Yuping, SHENG Chunquan, WU Shanchao. Screening of small molecule inhibitors against Fusobacteriumnucleatum and study of their anti-colorectal activity[J]. Journal of Pharmaceutical Practice and Service. doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202405009
|
DownLoad:
