Pharmacodynamic effects of Qiwei Zhigan prescription on non-alcoholic steatohepatitis in animal model

七味脂肝方供试品（江苏康缘药业股份有限公司提供，批号：Z201001），根据项目组前期制定的提取工艺，将七味脂肝方制备成每1 g含6.19 g生药的浸膏粉；维生素E（VE）软胶囊（上海信谊延安药业有限公司，国药准字H31020237，批号：03210202）；罗格列酮片（成都恒瑞制药有限公司，国药准字H20030569，批号：210601）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒（上海惠中生物科技有限公司，批号：01ALT210107、01AST210329、01ALP210222、02TG210330、01CHOL210226、01HDL210525、01LDL210302）；乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒（上海执诚生物科技有限公司，批号：ZCJULT019）；游离脂肪酸（FFA）、总胆红素（TBIL）测定试剂盒（美康生物科技股份有限公司，批号：210609101、190731101)；苏木素、伊红染色液（珠海贝索生物技术有限公司，批号：719041、719033）；F4/80抗体，（Abcam，批号：1004577-2）。

全自动生化分析仪（日本东芝，型号：TBA-40R）；全自动样品快速研磨仪（上海净信，型号：Tissuelyser-24）；轮转式石蜡切片机、冷冻切片机、组织包埋机（徕卡显微系统（上海）贸易有限公司，型号：RM2235、CM1950、Histocore Amber）；正置显微镜（日本OLYMPUS，型号：CX31RTSF）。

Sprague-Dawley大鼠（SD大鼠），雄性，6周龄，体重200～250 g，48只，购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部，生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006。C57BL/J小鼠，雌雄各半，6周龄，体重（24±2）g，96只，购置于上海吉辉实验动物饲养有限公司，生产许可证号：SCXK（沪）2017-0012。通过上海中医药大学实验动物中心实验动物伦理（伦理号：PZSHUTCM210625020）审查，实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2018-0006，SPF级环境饲养。

48只雄性SD大鼠，饲养于上海中医药大学实验动物中心，正常饮食，自由食水，观察7 d。第8天，根据动物体重按随机数字法随机分为对照组和模型组，除对照组外，其余动物饲料梯度替换为MCD饲料（正常饲料喂养；25%MCD饲料喂养2 d；50%MCD饲料喂养2 d；75%MCD饲料喂养2 d；100%MCD饲料喂养2周），自由食水。造模2周后，对模型组动物根据体重随机分组，分为模型组、七味脂肝方低剂量组（2.8 g/kg生药）、七味脂肝方中剂量组（5.6 g/kg生药）、七味脂肝方高剂量组（11.2 g/kg生药）、阳性对照VE组（40 mg/kg），每组8只。各给药组每天灌胃1次，连续28 d，对照组及模型组灌胃等量的生理盐水。

96只C57BL/J小鼠，雌雄各半，饲养于上海中医药大学实验动物中心，正常饮食，自由食水，观察7 d。第8天，根据动物体重按随机数字法随机分为对照组和模型组，除对照组外，其余动物饲料梯度替换为CDAHFHD饲料（正常饲料喂养；25%CDAHFHC饲料喂养2 d；50%CDAHFHC饲料喂养2 d；75%CDAHFHC饲料喂养2 d；100%CDAHFHC饲料喂养2周），自由食水。造模2周后，对模型组动物根据体重随机分组，分为模型组、七味脂肝方低剂量组（4 g /kg生药）、七味脂肝方中剂量组（8 g/kg生药）、七味脂肝方高剂量组（16 g/kg生药）、阳性对照罗格列酮组（RSG，1.14 mg/kg），每组16只。各给药组每天灌胃1次，连续28 d，对照组及模型组灌胃等量的生理盐水。

使用全自动生化分析仪测定ALT、AST、ALP、LDH、TG、TC、HDL-C、LDL-C、TBIL、FFA在血清中的水平。

取新鲜肝脏组织样本，加入1∶9（质量体积比）的匀浆介质（乙醇∶丙酮=1∶1），冰浴条件下匀浆，置于冰箱4 ℃过夜，4 000 r/min离心15 min，收集上清液样本，使用全自动生化分析仪测定TG、TC、HDL-C、LDL-C在肝脏组织中的水平。

肝脏左叶样本固定后，经组织脱水，石蜡包埋，将其切成4 μm的石蜡切片。

（1）HE染色

取肝脏石蜡切片样本，经HE染色，用正置显微镜拍照并评价肝脏病理变化。NASH病理诊断标准采用NAFLD活动度积分（NAS）进行评估（具体评判标准见表1）。

（2）Masson染色

取肝脏石蜡切片样本，经Masson三色染色，通过正置显微镜观察并拍照记录，评价肝组织纤维化程度。Masson染色纤维化诊断评分参照以下评分标准（表2）。

（3）免疫组织化学染色

取肝脏石蜡切片样本，经F4/80抗体免疫组织化学染色，通过正置显微镜观察并拍照记录，评价肝组织中Kupffer细胞的活化程度。

所有计量资料采用平均值±标准偏差（$ \bar{x}\pm s $）表示。计量资料采用单因素方差分析（one-sample Kolmogorov-Smirnov test）进行数据分布判断，正态分布时采用参数检验的单因素方差分析（ANOVA），偏态分布时采用非参数检验（Mann-Whitney test）。所有数据均使用GraphPad Prism 8软件进行统计并进行图表制作。

对照组肝脏表面光滑，色深红，质地软，有弹性，肝叶边缘锐利。与对照组相比，模型组肝脏体积增大，颜色变浅；与模型组相比，七味脂肝方各剂量组和阳性对照VE组可以观察到肝脏颜色稍红，各组均可一定程度改善肝脏形态，结果见图1和表3。

对照组肝脏表面光滑，色深红，质地软，有弹性，肝叶边缘锐利；与对照组相比，模型组肝脏体积增大，颜色变浅；与模型组相比，七味脂肝方各剂量组和阳性对照RSG组可以观察到肝脏颜色稍红，各组均可一定程度改善肝脏形态，结果见图2。

与对照组相比，模型组肝脏重量、肝脏指数显著升高（P<0.01）；与模型组相比，七味脂肝方的各剂量组和阳性对照RSG组均能显著降低肝脏重量（P<0.05或P<0.01），七味脂肝方的中、高剂量组和阳性对照RSG组能显著降低肝脏指数（P<0.01），结果见表4。

与对照组相比，模型组血清ALT水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，七味脂肝方中剂量组血清ALT水平显著降低（P<0.05），七味脂肝方中、高剂量组可改善血清ALP、LDH、HDL水平，结果见表5、表6。

与对照组相比，模型组血清ALT、AST、ALP、LDH、TG、TC、LDL水平显著升高（P<0.01），HDL水平显著降低（P<0.01）；与模型组相比，七味脂肝方低剂量组血清ALP、TG水平显著降低（P<0.05或P<0.01），七味脂肝方中剂量组血清LDH、TG水平显著降低（P<0.05），七味脂肝方高剂量组血清ALT、AST、ALP、LDH、TG水平显著降低（P<0.05或P<0.01），阳性对照RSG组血清ALT水平显著降低（P<0.05），结果见表7和表8。

与对照组相比，模型组血清TBIL、FFA水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，七味脂肝方高剂量组和阳性对照RSG组血清TBIL水平显著降低（P<0.05）。结果见表9。

与对照组相比，模型组肝脏TG水平显著升高（P<0.01），HDL水平显著降低（P<0.01）；与模型组相比，阳性对照VE组肝脏HDL水平显著升高（P<0.01），结果见表10。

与对照组相比，模型组肝脏TG、TC水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，七味脂肝方高剂量组肝脏TG水平显著降低（P<0.01），结果见表11。

对照组大鼠肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，肝板以中央静脉为中心呈放射状排列，未见明显病理性改变。

模型组镜下可见广泛的肝细胞空泡变性，中央静脉及汇管区周围可见肝细胞坏死，小叶间炎症细胞浸润，肝小叶结构被破坏。与对照组相比，模型组脂肪变性、小叶内炎症及NAS评分显著升高（P<0.01）。

与模型组相比，七味脂肝方的各给药组和阳性对照VE组可明显减轻小叶内炎症程度。与模型组相比，七味脂肝方低、中、高剂量组和阳性对照VE组小叶内炎症评分显著降低（P<0.05或P<0.01），七味脂肝方的中剂量组和阳性对照VE组NAS评分显著降低，结果见表12。

对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，肝板以中央静脉为中心呈放射状排列，未见明显病理性改变。

模型组镜下可见广泛的肝细胞空泡变性，中央静脉及汇管区周围可见肝细胞点状或灶状坏死，小叶间炎性细胞浸润，肝小叶结构被破坏，较多个肝细胞呈气球样变。与对照组相比，模型组脂肪变性、小叶内炎症、气球样变及NAS评分显著升高。

与模型组相比，七味脂肝方中、高剂量组可有效减轻炎性灶数量和肝细胞气球样变，显著降低小叶内炎症程度评分、气球样变评分及NAS评分（P<0.01），阳性对照RSG组可减轻小叶内炎症程度，显著降低小叶内炎症程度评分及NAS评分（P<0.01），结果见表13。

CDAHFHC诱导的小鼠NASH模型Masson染色结果显示，对照组肝小叶结构完整，肝细胞排列整齐，汇管区结构清晰，被染成蓝色的纤维结缔组织分布在肝小叶间血管和胆管周围,汇管区周围的纤维结缔组织呈围管状包绕血管及胆管分支。

模型组可见肝细胞点状或灶状坏死，炎症细胞浸润，镜下多个视野可见小叶内和汇管区周围被染成蓝色的胶原纤维增生。与对照组相比，模型组纤维化评分显著升高（P<0.01）。

与模型组相比，七味脂肝方的中、高剂量组可观察到肝小叶内和汇管区周围胶原纤维增生情况明显减轻，并呈现一定程度的剂量梯度效应；阳性对照RSG组在肝小叶和汇管区周围的胶原纤维增生情况也可得到一定程度的改善。与模型组相比，七味脂肝方的高剂量组纤维化评分显著降低（P<0.05），结果见表14。

MCD诱导的大鼠和CDAHFHC诱导的小鼠NASH模型F4/80免疫组织化学染色结果显示，对照组大鼠肝脏Kupffer细胞处于静息状态，为不规则或树枝状分布。

模型组可观察到在肝小叶炎性灶及汇管区周围大量的被激活的Kupffer细胞，呈现花冠状分布，被F4/80标记的阳性细胞数明显增加。

与模型组相比，七味脂肝方的中、高剂量组显示被F4/80标记的阳性细胞数密度降低，Kupffer细胞活化程度明显减弱，花冠状分布程度明显减轻，呈一定程度的浓度依赖；阳性对照VE组和RSG组同样可减轻Kupffer细胞活化程度，与文献报道一致，结果见图3、图4。

NASH是在非酒精性肝脂肪变基础上形成的，出现血清生化酶学超过正常值上限，肝穿刺病理组织学显示肝细胞脂肪变>5％，伴有炎症及肝细胞损伤（如气球样变），并除外导致肝脂肪变的其他原因，如大量饮酒、长期应用促脂肪形成药物或单基因遗传紊乱等的疾病^[1]。近年来，关于NASH发病机制的研究已取得很大进展，但目前治疗选择非常有限^[5-6]，FDA、SFDA尚未批准针对该疾病的有效药物。权威指南中推荐使用的药物有维生素E、吡格列酮等，但这些药物的有效性和安全性存在争议^[7-8]。目前，防治NASH的主要方法以生活方式干预为主，其他方法包括降糖、降脂和保肝的间接对症治疗，降低导致NASH的高危因素的相关疾病，使患者间接获益。

中医药因具有多因子、多靶点和多环节的协同药理效应，在治疗该类疾病具有独特的优势，在治NASH方面取得了一定进展^[9-11]。非酒精性脂肪性肝炎并无确切中医学病名^[12]，根据其临床表现可归属于“肝癖”、“胁痛”、“黄疸”等范畴。病位主要涉及肝脾，病久及肾。由于过食肥甘厚味，运化失职，使谷精不能尽化气血而凝为膏脂，导致肝失疏泄、脾失健运，痰浊淤积于肝；脾胃为气机升降之枢，湿浊困脾，脾气不升，一身气机运化失常，加剧肝气郁结和肝络失养。

七味脂肝方中酒豨莶草、垂盆草清热解毒、利湿退黄，二药合为君药；煅牡蛎软坚散结，《珍珠囊》谓其可“软痞积”，《本草纲目》谓“化痰软坚，清热除湿”，山楂消食积，散淤血，《本草纲目》认为其可“化饮食，消肉积，癥瘕，痰饮痞满吞酸，滞血痛胀”，海藻消痰软坚散结，利水消肿，三药共为臣药；虎杖协同加强解毒、化瘀、退黄之功效，为佐药；醋五味子收敛固涩、益气生津、补肾宁心，可补五脏气，为使药。全方七味药物相辅相成，达到湿、痰、瘀、毒兼顾，利湿解毒，消痰散结，用于NASH湿热痰瘀互结证。现代药理学表明，方中垂盆草中的槲皮素^[13]、虎杖中的虎杖苷等成分均对NASH有一定治疗作用^[14-15]。

NASH是一种更严重的NAFLD病理类型，NASH的特征是存在肝细胞损伤、肝脂肪变性、炎症和纤维化，进而发生肝硬化并增加肝细胞癌的风险^[16]。在NASH发展过程中，肝脏内脂肪合成量不断上升，代谢功能逐渐下降，肝脏对脂质的摄取和代谢能力随之减弱，导致脂质代谢过程中TC、TG和LDL-c含量升高，同时受损的肝细胞还会释放AST、ALT活力到血液中，导致AST、ALT活力升高，这些指标的异常变化可作为NASH的标志^[17]。肝内过量的脂质沉积可导致炎症反应，促使单纯性脂肪肝向NASH的病理进展^[18]。肝纤维化是肝细胞外基质的弥漫性过度沉积与异常分布，是肝脏对慢性损伤的病理性修复反应。目前，肝组织病理学检查仍是肝纤维化诊断的“金标准”。目前的科学研究普遍认为，Kupffer细胞对NAFLD的发生和发展至关重要，如果它们被适度激活，可以发挥防御作用，但如果它们被过度激活，将释放大量的促炎细胞因子，这对肝组织和其他细胞会造成一定程度的损伤。已有文献表明，活化的肝脏巨噬细胞可以促进NASH的进展^[19]。

本研究在MCD诱导的大鼠和CDAHFD诱导的小鼠两个经典NASH模型的实验结果显示，经过2周的诱导后，模型组的肝脏质量以及ALT、AST、ALP、LDH、TG、TC、LDL、TBIL及FFA水平显著高于对照组，HE、Masson及免疫组化染色显示，肝脏组织炎症和肝细胞脂肪变性严重，NAS评分显著增加，肝小叶内和汇管区周围胶原纤维增生及Kupffer细胞活化程度加重，说明建立NASH模型成功。经4周的给药后，七味脂肝方能显著降低上述指标，此外，HE、Masson及免疫组化染色显示，七味脂肝方能显著减轻肝脏组织炎症程度，降低肝脏组织病理NAS评分，减轻肝纤维化及Kupffer细胞活化程度。说明七味脂肝方能有效降低血脂、调节肝脏脂质代谢紊乱，改善NASH小鼠肝脏炎症损伤向肝纤维化发展的趋势，改善肝脏组织病理损伤，从而有效减缓并改善NASH的进展程度。

NASH的发病机制尚未完全阐明，目前公认的是“多重打击”理论，其认为胰岛素抵抗、脂肪毒性、炎症、氧化应激等多种致病因素共同导致了NASH的发生发展，而炎症在NASH的恶化过程中扮演着至关重要的角色^[18]。肝脏具有密集的吞噬细胞网络，在非炎症条件下维持耐受性，并快速感知肝细胞损伤和氧化应激信号，导致促炎级联反应的激活。在损伤后，白细胞迅速渗入肝实质，通过产生可溶性介质激活其他免疫细胞和非实质细胞群，从而促进炎症和纤维化的发生。炎症介质可以激活肝星状细胞（HSCs），HSCs是肝纤维化形成过程中的主要效应细胞，导致细胞外基质过度沉积，形成创伤愈合或瘢痕反应，进一步促进纤维化发展。活化的HSCs产生促炎介质，进而使肝脏炎症持续存在，导致炎症的慢性循环和瘢痕组织的形成，最终导致器官衰竭^[20]。因此，抑制炎症对于NASH的预防和治疗具有重要意义，深入理解NASH相关的炎症信号通路（NF-κB和MAPK等），并找到能够有效靶向特定炎症的靶点，将为治疗NASH提供更多的思路和新的策略。已有多次报道NF-κB信号通路参与NASH中炎症反应，损伤相关分子模式（DAMPs）激活Kupffer细胞，诱导细胞内的NF-κB信号激活^[21]。本研究病理染色结果证明，七味脂肝方可减少炎性浸润，减轻肝纤维化程度，改善NASH动物肝脏的病理表现，后续将继续探究七味脂肝方药效物质基础作用的炎症通路，进一步阐明其治疗NASH的机制。

本研究结果初步提示，七味脂肝方可能是通过改善NASH肝脏炎症损伤，继而阻碍其向肝纤维化发展的趋势来发挥药效，为其后续机制探究提供研究方向。针对目前的NASH临床需求，七味脂肝方具有较好的临床价值。