Synthesis and anti-inflammatory activity of oridonin sulfonylurea derivatives

WU Ruonan; YE Shuang; LI Mochenxuan; MIAO Zhenyuan; LUO Chuan

doi:10.12206/j.issn.2097-2024.202401048

Objective To study anti-inflammatory activities of oridonin derivatives without Michael fragment. Methods Two oridonin sulfonylureas were designed and synthesized by a photocatalysis reaction and a scaffold hopping strategy. The inhibitory rate of IL-1β was selected for anti-inflammatory activity evaluation. Results Both compound ZM658 and ZM659 revealed potent anti-inflammatory activities with the values of 69.3% and 59.7% in THP-1 cells, respectively. Moreover, two compounds also showed dose-dependent and low cytotoxicity. Conclusion The result indicated that Michael receptor fragment of oridonin could be substituted with sulfonylurea group.

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NLRP3（NLR family pyrin domain containing 3）炎症小体作为固有免疫的重要组分，在机体免疫反应、炎症性疾病发生和发展过程中发挥着重要作用。NLRP3炎症小体包括传感器（NLRP3受体蛋白）、适配器（含有CARD的凋亡相关斑点样蛋白）和效应器（caspase-1蛋白），其中，NLRP3受体蛋白是炎症反应中的关键调控蛋白^[1]。研究发现，NLRP3炎症小体的激活可以分为经典激活途径和非经典激活途径，在NLRP3炎症性小体的经典激活途径中，激活全过程可以分为启动和激活两阶段。NLRP3炎症小体的激活在先天免疫反应调节中起着关键作用，但过度激活会导致自身免疫性疾病、中枢神经系统疾病、代谢性疾病、心血管疾病和癌症等多种疾病的发生和进展^[2-4]。因此，以NLRP3炎症小体为靶点的药物研发成为药物设计领域的热点^[5-6]。

迄今为止报道的NLRP3抑制剂可分为直接抑制NLRP3炎症小体激活的抑制剂和通过抑制炎症小体成分或相关信号通路来间接抑制NLRP3炎症小体激活的抑制剂（图1）^[7-8]。Canakinumab是诺华制药公司研发的一种能抑制IL-1β活性的抗IL-1β单克隆抗体，在2009年获得美国食品药物管理局批准用于对冷吡啉相关周期性综合征患者的治疗^[9]。MCC950是由辉瑞公司研发的二芳基磺酰脲类NLRP3炎性小体抑制剂，目前已进入临床研究。MCC950能直接与NLRP3受体蛋白NACHT结构域的Walker B基序产生非共价结合，使NLRP3炎症小体处于非活性状态，抑制NLRP3活化和ASC寡聚，阻断NLRP3 炎症小体的经典和非经典激活途径^[10-11]。此外，还有多个小分子抑制剂也进入了临床试验阶段^[12]。

天然产物是新药研发中先导化合物的重要来源，冬凌草甲素是从中药材冬凌草中提取分离得到，具有抗肿瘤、抗炎、抗菌等多种药理活性的四环二萜类化合物。研究发现，冬凌草甲素通过靶向NLRP3受体蛋白的Cys279来阻断NLRP3和NEK7之间的相互作用，特异性抑制NLRP3炎症小体的激活。其中，冬凌草甲素中的迈克尔受体片段被认为是产生活性的关键药效团^[13-15]。为进一步研究冬凌草甲素的抗炎活性构效关系，研发基于天然产物冬凌草甲素的新型NLRP3炎症小体抑制剂，本课题组采用光催化化学反应^[16]和骨架跃迁药物设计策略，设计合成出一类冬凌草甲素磺酰脲类衍生物，并考察其抗炎活性。

1. 仪器与试剂

实验所用试剂分别采购自泰坦、毕得、乐研等公司，各类试剂均为市售分析纯或化学纯。600 MHz型核磁共振波谱仪（德国 Bruke 公司），采用 TMS 作为内标，使用 DMSO-d6或D₂O 等为溶剂。耦合常数（J）和化学位移（δ）单位分别用 Hz 和 ppm 表示。高分辨质谱采用的是德国 Bruke micrOTOF 10257。薄层色谱（TLC）使用的硅胶板为 GF254（中国青岛海洋化学），柱层析使用的是 200 ~ 300目硅胶（中国青岛海洋化学）。

2. 实验方法

2.1. 叔丁基（2-（（1S, 4aR, 5S, 6S, 6aR, 8S, 11aS, 11bS, 14R）-1,5,6,14-四羟基-4,4-二甲基-7-氧代十二氢-1H-6,11b-（环氧基甲烷）-6a,9-甲基环庚烷[a]萘-8-基）乙基）氨基甲酸酯（2）的制备

将冬凌草甲素（473 mg，1.20 mmol）、N-Boc-甘氨酸（252 mg，1.44 mmol）光催化剂Ir[dF（CF₃）ppy]₂（dtbbpy）PF₆（14 mg，0.012 mmol）和DMF（6 ml）加入到10 ml玻璃瓶中。然后，加入磷酸氢二钾（251 mg，1.44 mmol），密封玻璃瓶，脱气15 min后充入氮气，在蓝光LED灯带照射下室温反应36 h。反应结束后加入10 ml水，乙酸乙酯萃取3次（10 ml × 3）。合并有机相，水洗（10 ml），无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂，柱色谱纯化得507 mg黄色固体2（二氯甲烷∶甲醇=100∶3），收率85.0%。¹H NMR（600 MHz, DMSO-d6）δ 6.87（t, J = 5.5 Hz, 1 H）, 6.78（s, 1 H）, 6.08（d, J = 2.1 Hz, 1 H）, 5.71（d, J = 10.9 Hz, 1 H）, 4.80（s, 1 H）, 4.35（d, J = 5.0 Hz, 1 H）, 4.10（d, J = 5.0 Hz, 1 H）, 4.07（d, J = 10.1 Hz, 1 H）, 3.83（d, J = 10.4 Hz, 1 H）, 3.42（dd, J = 10.9, 6.2 Hz, 1H）, 3.32（dd, J = 11.0, 5.5 Hz, 1H）, 2.97 − 2.93（m, 1H）, 2.82（dd, J = 14.8, 6.8 Hz, 1H）, 2.42（t, J = 8.6 Hz, 1H）, 2.00（dt, J = 12.7, 9.3 Hz, 1H）, 1.92 − 1.85（m, 1H）, 1.84 – 1.75（m, 1H）, 1.67 − 1.57（m, 1H）, 1.54 − 1.41（m, 5H）, 1.38（s, 9H）, 1.32（d, J = 13.3 Hz, 1H）, 1.24 − 1.16（m, 1H）, 1.09（d, J = 6.2 Hz, 1H）, 1.00（s, 3H）, 0.97（s, 3H）. HRMS（ESI）: m/z [M + H]⁺ calculated for C₂₆H₄₁NO₈: 518.2730; found: 518.2724。

2.2. （1S, 4aR, 5S, 6S, 6aR, 8S, 11aS, 11bS, 14R）-8-（2-氨基乙基）-1,5,6,14-四羟基-4,4-二甲基脱氧-1H-6,11b-（环氧基甲烷）-6a,9-甲基环庚烷-7（8H）-酮三氟乙酸盐（3）的制备

将化合物2（149 mg, 0.2 mmol）加入到25 ml单口瓶中，然后加入2 ml二氯甲烷和TFA（1.5 ml，19.5 mmol），室温下反应1.5 h。反应结束后减压蒸去溶剂，得122 mg黄色晶体3，收率79.8%。¹H NMR（600 MHz, D₂O）δ 4.99（d, J = 1.5 Hz, 1H）, 4.16（d, J = 10.2 Hz, 1H）, 4.03（d, J = 10.2 Hz, 1H）, 3.57（t, J = 7.3 Hz, 1H）, 3.48 – 3.45（m, 1H）, 3.09 − 2.95（m, 3H）, 2.55（t, J = 8.1 Hz, 1H）, 2.05 − 1.95（m, 3H）, 1.87 − 1.84（m, 1H）, 1.74–1.69（m, 1H）, 1.63 − 1.56（m, 1H）, 1.56 − 1.47（m, 1H）, 1.47 − 1.35（m, 3H）, 1.27–1.25（m, 1H）, 1.22–1.18（m, 1H）, 1.00（s, 3H）, 0.93（s, 3H）。

2.3. 4-甲基-N-（2-（（1S, 4aR, 5S, 6S, 6aR, 8S, 11aS, 11bS, 14R）-1,5,6,14-四羟基-4,4-二甲基-7-氧代十二氢-1H-6,11b-（环氧甲烷）-6a, 9-甲基环庚烷[a]萘-8-基）乙基）氨基甲酰基）苯磺酰胺（ZM658）的制备

向10 ml单口瓶中分别加入化合物3（51 mg, 0.1 mmol）、2 ml二氯甲烷和三乙胺25.9 μl（20 mg, 0.2 mmol），冷却至0 ^oC，缓慢加入对甲苯磺酰异氰酸酯（19.7 mg, 0.1 mmol），缓慢升至室温反应过夜。反应结束后加入5 ml水，二氯甲烷萃取（5 ml × 3），合并有机相。有机相用水洗涤（10 ml），无水Na₂SO₄干燥，减压蒸去溶剂，柱层析纯化得30 mg白色固体（二氯甲烷∶甲醇=100∶5），收率25.9%。¹H NMR（600 MHz, DMSO-d6）δ 10.59（s, 1H）, 7.77（d, J = 8.3 Hz, 2H）, 7.39（d, J = 8.0 Hz, 2H）, 6.77（s, 1H）, 6.57（s, 1H）, 6.07（d, J = 2.2 Hz, 1H）, 5.66（d, J = 10.9 Hz, 1H）, 4.77（s, 1H）, 4.34（d, J = 5.0 Hz, 1H）, 4.05（d, J = 10.2 Hz, 1H）, 3.82（d, J = 10.8 Hz, 1H）, 3.41（dd, J = 11.0, 6.2 Hz, 1H）, 3.29（dd, J = 10.8, 5.2 Hz, 1H）, 2.98（dd, J = 13.3, 7.0 Hz, 2H）, 2.73（s, 1H）, 2.39（s, 3H）, 2.36 – 2.32（m, 1H）, 1.96（dd, J = 13.5, 7.9 Hz, 1H）, 1.80（dd, J = 19.6, 10.1 Hz, 1H）, 1.72（dd, J = 13.5, 6.5 Hz, 1H）, 1.58（dd, J = 13.2, 6.2 Hz, 1H）, 1.53 – 1.37（m, 4H）, 1.33（d, J = 11.9 Hz, 2H）, 1.18（dd, J = 15.2, 12.0 Hz, 1H）, 1.06（d, J = 5.0 Hz, 1H）, 0.99（s, 3H）, 0.96（s, 3H）.¹³C NMR（151 MHz, DMSO-d6）δ 224.71, 129.23, 128.93, 128.51, 127.12, 97.02, 73.66, 73.52, 71.92, 63.23, 61.67, 60.54, 52.97, 48.52, 45.88, 40.58, 38.83, 38.14, 36.92, 33.80, 32.97, 29.73, 26.34, 21.91, 21.38, 19.62, 18.71.HRMS（ESI）: m/z [M + Na]⁺ calculated for C₂₉H₄₀N₂O₉S: 615.2353; found: 615.2347。

2.4. N-（2-（（1S, 4aR, 5S, 6S, 6aR, 8S, 11aS, 11bS, 14R）-1,5,6,14-四羟基-4,4-二甲基-7-氧代十二氢-1H-6,11b-（环氧甲烷）-6a, 9-甲基环庚烷[a]萘-8-基）乙基）氨基甲酰基）苯磺酰胺（ZM659）的制备

参考化合物ZM658的合成操作步骤，以苯磺酰异氰酸酯代替对甲苯磺酰异氰酸酯，得白色固体，收率17.3%。¹H NMR（600 MHz, DMSO-d6） δ 10.66（s, 1H）, 7.91 – 7.86（m, 2H）, 7.66（t, J = 7.3 Hz, 1H）, 7.59（t, J = 7.7 Hz, 2H）, 6.77（s, 1H）, 6.56（s, 1H）, 6.06（d, J = 1.8 Hz, 1H）, 5.66（d, J = 10.9 Hz, 1H）, 4.77（s, 1H）, 4.33（d, J = 5.0 Hz, 1H）, 4.05（d, J = 10.2 Hz, 1H）, 3.82（dd, J = 10.2, 1.3 Hz, 1H）, 3.41（dd, J = 11.0, 6.2 Hz, 1H）, 3.30 – 3.27（m, 1H）, 2.98（dd, J = 13.2, 6.6 Hz, 2H）, 2.74（dd, J = 15.1, 6.5 Hz, 1H）, 2.35（t, J = 8.7 Hz, 1H）, 1.95（td, J = 13.2, 7.6 Hz, 1H）, 1.87 – 1.78（m, 1H）, 1.74（td, J = 13.3, 7.4 Hz, 1H）, 1.58（dd, J = 12.7, 6.2 Hz, 1H）, 1.52 – 1.33（m, 5H）, 1.30（dd, J = 10.1, 3.3 Hz, 1H）, 1.18（td, J = 13.6, 3.2 Hz, 1H）, 1.07（d, J = 6.1 Hz, 1H）, 0.99（s, 3H）, 0.96（s, 3H）.¹³C NMR（151 MHz, DMSO-d6） δ 224.45, 152.19, 141.13, 133.38, 129.40, 127.51, 97.03, 73.62, 73.55, 71.93, 63.24, 61.65, 60.53, 52.94, 49.06, 48.43, 38.84, 38.18, 37.04, 33.80, 32.98, 29.74, 26.01, 21.92, 19.61, 18.70. HRMS（ESI）: m/z [M + Na]⁺ calculated for C₂₈H₃₈N₂O₉S: 601.2196; found: 601.2190。

2.5. 细胞毒活性和抗炎活性测试

选用人单核细胞白血病细胞（THP-1，普诺赛）作为试验细胞株。所有目标化合物用药用级DMSO配置成对应浓度的药液，阳性药物以同样的条件配成对照品溶液。采用CCK-8法测化合物细胞毒性。将THP-1细胞置于96孔板中，用100 ng/ml PMA刺激48 h。取上清液，用含有Ori或不同浓度目标化合物的新鲜培养基替换。然后用Ori或不同浓度目标化合物处理细胞24 h。用含有CCK8（10 μl）的新鲜培养基替换培养上清液，并在37 ^◦C下继续培养3 h。用酶标仪在450 nm处记录吸光度（A）值，根据A值计算细胞活力。

THP-1细胞在完全培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素合剂和0.05 mmol β-巯基乙醇的RPMI1640培养基）、含有5%二氧化碳和95%空气的37 ^◦C的无菌环境中培养。吸出培养瓶中的含THP-1细胞的培养基，1 000 r/min离心3 min，用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为510⁵ 个/ml，接种于24孔板中，每孔细胞培养基混合液1 ml。加入浓度为100 ng/ml的PMA，刺激THP-1细胞48 h。将PMA分化的THP-1细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤，然后在基础培养基中用100 μg/ml的LPS处理3 h。去除培养基，向24孔板中分别加入各浓度的化合物培养基，混匀，孵箱孵育处理24 h，ATP（5 mmol/L）刺激细胞 1 h。收集细胞培养上清液，12 000 r/min离心5 min，去除死细胞，使用ELISA法分析细胞上清液中的1L-1β抑制率。

4. 结论

基于光催化反应和骨架跃迁药物设计策略，以磺酰脲片段代替冬凌草甲素的关键药效团——迈克尔受体片段，设计合成出2个冬凌草甲素磺酰脲衍生物。细胞毒活性测试表明，新化合物的毒性较小，低于先导物冬凌草甲素。抗炎活性研究发现，冬凌草甲素磺酰脲衍生物均显示出优秀的抗炎活性，化合物ZM658在20 μmol/L浓度时，对IL-1β的抑制率优于冬凌草甲素，并且随着浓度的提高也呈现出一定的量效关系。本研究结果初步表明，冬凌草甲素的迈克尔受体片段并非是其作为NLRP3炎症小体抑制剂的必需药效团，这为以冬凌草甲素为骨架的新型NLRP3炎症小体抑制剂的进一步研究提供了新的优化设计思路。

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化合物	IL-1β抑制率（%）		CC₅₀（μmol/L）
化合物	20 μmol/L	50 μmol/L	CC₅₀（μmol/L）
ZM658	69.3	75.7	>100
ZM659	59.7	60.8	>100
2	9.8	22.8	>100
3	−8	4.0	>100
冬凌草甲素	63.0	90.1	19.8

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doi: 10.12206/j.issn.2097-2024.202401048

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通讯作者: 陈斌, [email protected]

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