Simultaneous determination of three constituents in Chunyang Zhengqi capsules by HPLC

Agilent1260 Infinity型高效液相色谱仪、DAD检测器（Agilent Technologies公司）；XS205DU型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-600E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

纯阳正气胶囊（批号：200901、201201、210201、211001，八加一药业股份有限公司）；橙皮苷对照品（批号：110721-202019）、桂皮醛对照品（批号：110710-201821）、丁香酚对照品（批号：110725-201917）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，Merck公司）；其他试剂均为分析纯；水为去离子水。

色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C₁₈（4.6 mm×150 mm,4 μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序为0 ~5 min，15%乙腈；5 ~10 min，15%~25%乙腈；10 ~12 min，25%~ 50%乙腈；12 ~16 min，50%~15%乙腈；柱温为35 ℃；检测波长为284 nm；流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl。

取橙皮苷、桂皮醛和丁香酚对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成浓度为1125、510、991 μg/ml的标准储备液。精密吸取橙皮苷储备液5 ml、桂皮醛储备液1.25 ml、丁香酚储备液4 ml置于同一25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品储备液适量，加甲醇稀释制成含橙皮苷36 μg/ml、桂皮醛4.08 μg/ml和丁香酚25.37 μg/ml的混合对照品溶液。

取本品10粒内容物研磨均匀，取粉末约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，称定重量，超声20 min，放冷至室温，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按纯阳正气胶囊处方及制剂工艺，分别制成缺陈皮、缺肉桂和缺丁香的阴性样品，取阴性样品按“2.3”项下供试品溶液的制备方法制备阴性对照溶液。

分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样，记录色谱图及相关参数。橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的保留时间依次为6.983、10.399、11.729 min，分离度均大于1.5，理论塔板数按橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰计算分别为54733、59111和83997，且阴性样品在对照品相应位置没有吸收峰，表明其他成分对测定无干扰，结果见图1。

分别精密吸取“2.2”项下的混合对照品储备液0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，按“2.1”项下的色谱条件进行测定。以峰面积Y对浓度X（μg/ml）进行线性回归，结果见表1。

取“2.2”项下制备的混合对照品溶液， 按“2.1”项下的色谱条件进行测定，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的峰面积RSD分别为1.21%、1.14%、0.96%(n=6)，表明该方法精密度良好。

取“2.3”项下制备的供试品溶液（批号：210201），分别于0、2、4、6、8、12、24 h按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积。结果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚峰面积的RSD分别为1.28%、1.38%、2.77%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

取同一批次的纯阳正气胶囊（批号：210201）6份，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量。结果橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均含量分别为4.14、0.45、3.06 mg/g，RSD分别为1.43%、1.71%、1.63%（n=6），表明该方法的重复性良好。

取已知含量的同一批次的纯阳正气胶囊9份（批号：210201），每份约0.1 g，分别精密加入混合对照品储备液适量，配制成低、中、高3个不同浓度的回收率溶液，每个浓度3份，按“2.3”项下供试品溶液的制备方法操作，按“2.1”项下的色谱条件测定，记录峰面积并计算回收率。结果显示，橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的平均回收率分别为101.9%、98.0%、101.2%，RSD值分别为2.3%、1.6%、2.3%(n=9)。

取4批样品，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰面积并计算含量，结果见表2。

对于流动相的选择，本实验参考相关研究分别考察了乙腈-0.5%磷酸溶液^[8]、甲醇-水^[9]、乙腈-水^[10]作为流动相时对橙皮苷、桂皮醛、丁香酚色谱峰的影响。其中，乙腈-0.5%磷酸流动相无法使3种成分分离；甲醇-水流动相峰形矮且不尖锐，基线不平稳；乙腈-水流动相效果最佳，3种成分分离度均大于1.5，峰形良好。对于检测波长的选择，DAD检测器全波长扫描显示橙皮苷、桂皮醛、丁香酚分别在282、290、284 nm波长处有最大吸收，3种成分最大吸收波长相近，故选择284 nm作为检测波长，不影响3种成分的吸收。

纯阳正气丸对橙皮苷的含量测定采用了加热回流的方法，因此本实验分别考察了回流和超声两种提取方式。加热回流提取时桂皮醛含量的RSD较大，回收率差，考虑桂皮醛属于易挥发性物质^[11]，受温度影响大，文献[12]报道也多以超声提取为主，最终选择以超声作为提取方式，分别考察了超声时间和提取溶剂。分别比较20、30、40 min超声的提取效果，20 min为最佳提取时间；考虑橙皮苷、桂皮醛和丁香酚在溶剂中的溶解度，分别比较了甲醇、乙醇、稀乙醇和50%乙醇的提取效果，结果显示甲醇提取时指标成分含量较高，且无峰干扰，提取效果好。最后确定以甲醇作为提取溶剂，超声提取20 min的提取方法，简单便捷、结果准确。

对4批纯阳正气胶囊中橙皮苷、桂皮醛和丁香酚的含量进行分析，结果显示不同批次样品橙皮苷和桂皮醛的含量差异较大，丁香酚的含量波动较小，这有可能与不同来源和不同批次药材的质量有关，这提示我们在制订含量限度的时候除了要控制工艺，还要充分考虑药材对终产品的影响，本次试验只测定了4批不同批次的纯阳正气胶囊样品，后续将增加更多不同批次的样品进行测定研究，提升纯阳正气胶囊的质量标准。