Wilforine inhibits LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 cells by regulating the TLR4/MyD88/TRAF6 signaling pathway

雷公藤次碱（纯度98%，上海纯优生物科技有限公司）；DMEM细胞培养基、胎牛血清（Life Technologies GIBCO）；Griess试剂、细胞计数盒-8 (CCK-8)（上海碧云天生物技术有限公司）；脂多糖（LPS， Sigma-Aldrich）；IL-1β、TNF-α和IL-6检测试剂盒（达科为生物技术有限公司）；核质提取试剂盒（Dojindo Laboratories）；TRAF6、IRAF、p-IRAF、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65、β-actin、HRP山羊抗兔抗体（Cell Signaling Technology）；RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库。

RAW264.7细胞在含10％的新生小牛血清及100 U/ml青霉素、链霉素的DMEM高糖培养液中进行培养，培养条件为5％CO₂、37 ℃，隔天换液，每日观察细胞的生长状况。实验时取对数生长期RAW264.7细胞，胰酶消化，加入新鲜培养基反复吹打成细胞混悬液，细胞增殖实验、细胞因子分泌含量测定调整细胞浓度为1×10⁵ cells/ml，以每孔100 μl细胞悬液接种于96孔细胞培养板中，细胞蛋白表达测定调整细胞浓度到2.25×10⁵ cells/ml，以每孔2 ml接种于6孔细胞培养板中，然后细胞置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养过夜。在药物处理前2 h给予LPS溶液（使其终浓度为1 μg/ml）诱导RAW264.7细胞发生炎症反应建立模型。设空白组（不给予LPS和药物处理）、模型组（给予LPS处理）、药物组（给予LPS诱导后再给予相应浓度的药物进行处理），每组设6个复孔(n=6)。

设空白组和药物组，药物组分别给予终浓度为200、100、50和25 μmol/L的雷公藤次碱药液进行处理。细胞分别培养24和48 h，实验结束4 h前加入10 μl CCK-8试剂，结束后以酶标仪于450 nm处检测吸光度（A）。

设空白组、模型组和药物组，药物组细胞给予LPS诱导后分别给予终浓度为100、50、25 μmol/L的药液进行处理。细胞培养24 h后取出，吸取细胞上清液，Griess试剂法检测上清中NO光密度值，ELISA试剂盒检测上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的光密度值。

设空白组、模型组和药物组，药物组细胞给予LPS诱导后分别给予终浓度为100、50、25 μmol/L的药液进行处理。细胞培养24 h后取出，用4 ℃预冷的PBS液洗涤各孔两次，然后，吸弃PBS液，每孔中加入200 μl 4 ℃预冷的RIPA提取细胞蛋白，在13000 r/min下离心20 min，弃去上清，得各样本。用Bradford法对蛋白定量；使用细胞核/质提取试剂盒制备用于检测p65/NF-κB的胞质和核提取物。每孔加入20 μg蛋白上样，在SDS-PAGE凝胶中电泳，蛋白转移到PVDF膜上，用BSA封闭2 h。分别用相应一抗4 ℃孵育过夜，然后用与辣根过氧化物酶偶联的二抗（1∶1000）孵育2 h。最后用 ECL超敏发光液显影，于凝胶成像仪中曝光，使用 LAS成像软件对条带进行定量分析

实验数据的统计分析用($ \bar x \pm s $)表示，采用单因素方差分析法进行统计学处理。应用Alpha软件处理Western Blot实验所得目标带的光密度值，并以各自的β-actin蛋白条带灰度值与目标条带灰度值的比值作为蛋白相对表达水平值。

图1显示了不同浓度雷公藤次碱对RAW264.7细胞的细胞毒性作用。给予雷公藤次碱（25~200 μmol/L）孵育24 h后，200 μmol/L雷公藤次碱可显著抑制RAW264.7细胞活性；孵育48 h后，50、100和200 μmol/L雷公藤次碱均可显著抑制RAW264.7细胞的活性。

为了进一步研究雷公藤次碱体外抗炎活性，检测了雷公藤次碱对LPS刺激RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响。结果显示（图2），给予LPS刺激后的RAW264.7细胞，NO、IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子释放水平急剧增加（P<0.01），给予不同浓度雷公藤次碱（100、50和25 μmol/L）处理后，上述因子分泌水平呈剂量依赖性显著降低（P<0.01）。由此提示，雷公藤次碱的抗炎作用可能与抑制细胞释放NO、IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子有关。

LPS是引发炎症的早期关键因素，可诱发多种细胞内信号事件，LPS-TLR4/MyD88信号通路可调节促炎基因表达，并控制炎症相关细胞因子的表达，其中IRAK及TRAF6是MyD88依赖性途径中的关键信号传导的分子。TLR4受体受LPS诱导后，可导致IRAK磷酸化从而脱离MyD88与TRAF6的结合体，使得游离的TRAF6活化后续信号转导途径^[6]。为了评估雷公藤次碱对LPS激活TLR4/MyD88信号通路的影响，蛋白印迹法考察了雷公藤次碱对IRAK磷酸化和TRAF6表达的影响。结果显示（图3），与空白组相比，LPS刺激的模型组IRAK磷酸化和TRAF6表达明显增加（P<0.01）；与模型组相比，雷公藤次碱各剂量组可显著抑制IRAK磷酸化和降低TRAF6表达（P<0.01）。

NF-κB是MyD88信号通路中重要的转录因子^[7]。我们考察了雷公藤次碱对LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κB活化的潜在影响。如图4所示，RAW264.7细胞LPS刺激后，细胞核内NF-κB p65水平增高而细胞质内NF-κB p65水平降低，说明NF-κB p65活化后由细胞质进入到细胞核内，而给予雷公藤次碱处理后，细胞质内NF-κB p65水平增高而细胞核内NF-κB p65水平降低，说明雷公藤次碱以浓度依赖的方式显著地阻止了NF-κB p65从细胞质转运到细胞核。 NF-κB p65易位进入核内与TLR4途径中的IκBα磷酸化有关。因此，我们考察了雷公藤次碱对NF-κB抑制蛋白IκBα磷酸化的影响。结果表明，雷公藤次碱以浓度依赖的方式显著抑制LPS诱导的IκBα磷酸化和降解。

MAPKs是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。为了进一步研究雷公藤次碱是否调节MAPKs，考察了其对LPS诱导的RAW264.7细胞中ERK、p38和JNK等MAPKs磷酸化的影响。如图5所示，LPS暴露可显著促进RAW264.7细胞中ERK、JNK和p38的磷酸化。给予雷公藤次碱可以显著抑制LPS诱导的ERK、p38和JNK的磷酸化，但并未影响ERK、p38和JNK的表达。上述结果表明，MAPKs的磷酸化可能参与了雷公藤次碱对RAW264.7细胞中LPS刺激炎症的抑制作用。

雷公藤次碱是雷公藤的代表性生物碱成分之一，但是自从被分离以来，其生物学活性除了杀虫外，其他方面了解甚少^[8]。本研究显示，雷公藤次碱对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型显示出显著的抗炎活性。雷公藤次碱可减少LPS刺激引起的NO、IL-1β、TNF-α及IL-6等促炎因子的产生，并抑制LPS诱导的TLR4/MyD88通路中信号传导的分子IRAK磷酸化及TRAF6表达，从而影响MAPKs和NF-κB的激活，如图6所示。

已有证据显示，LPS可引发多种细胞内信号事件，包括导致TLR4，NF-κB及p38，ERK和JNK等丝裂素活化蛋白激酶（MAPKs）途径激活^[9-10]。研究发现，LPS诱导后RAW264.7细胞Toll样受体4（TLR4）的表达明显增高，说明LPS是或可引导TLR4的配体与TLR4结合，二者结合后可启动细胞内一系列信号级联反应，最终诱导目的基因的表达。TLRs亚型中除TLR3外，均需要髓样分化因子88（MyD88）来激活下游释放信号分子的通路，这种途径成为MyD88依赖性途径。静息状态下，MyD88与IRAK及TRAF6形成细胞信号转导复合物，受到诱导后导致IRAK磷酸化，IRAK磷酸化后TRAF6从信号转导复合物中解离出来，TRAF6的活化可引起两条不同的信号转导途径，一条为MAPK家族（包括p38、JNK），另一条为活化MP3K（mitogen activated protein kinase kinase kinase）家族成员NIK（NF-κB inducing kinase），后者的磷酸化激活IκB激酶，导致IκB的磷酸化而使NF-κB/IκB复合物解离，NF-κB由此活化转位进入细胞核^[11]。在本研究中，数据显示雷公藤次碱可以抑制IRAK磷酸化和TRAF6的表达。

NF-κB是一种多效性的转录因子，参与调控炎症反应、免疫、肿瘤等相关的细胞因子、趋化因子、黏附分子、炎症介质等的转录过程。IκB是其抑制蛋白，正常情况下二者结合而使NF-κB处于失活状态，IκBα是IκB的亚分子，受到LPS刺激，IκBα磷酸化增加，从而导致游离NF-κB p65释放并从细胞质转移至细胞核，与DNA上的相应位点结合，导致特定靶基因（如TNF-α、IL-1β和IL-6）的转录表达^[12-13]。在本研究中，数据显示雷公藤次碱可抑制IκBα磷酸化，并以浓度依赖的方式阻止NF-κB p65由细胞质进入细胞核，从而阻止炎症相关因子的转录表达。

此外，NF-κB的易位也受ERK、p38和JNK等丝裂素活化蛋白激酶途径调节，该途径可控制炎症反应过程中细胞因子的合成和释放。丝裂素活化蛋白激酶激活后，细胞质或细胞核中的转录因子又被激活，从而触发引起生物学反应的靶基因的表达，包括促炎性介质的表达。本研究显示，LPS诱导的RAW264.7细胞中，雷公藤次碱可显著抑制ERK、JNK和p38的磷酸化。