Preparation and in-vitro drug release of Baizhu Huanglian pellets containing colon-targeting capsules

101A-2型干燥箱（上海实验仪器总厂）；AG285十万分之一电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；SB100D超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；5804R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；FlexStream™ MP1流化床、NICA™ E140挤出机、NICA™ S450滚圆机（德国基伊埃技术设备有限公司）；RCZ-6C3型药物溶出仪（上海黄海药检仪器厂）。

白术挥发油（批号：XC20170225）、黄连提取物（批号：XC20170113）、防风提取物（批号：XC20170216）购自西安小草植物科技有限公司；盐酸小檗碱对照品（按含C₂₀H₁₈ClNO₄计为86.7%，批号：5UVU-ZFW7）购自中国食品药品检定研究院；β-环糊精（β-CD，曲阜市天利药用辅料有限公司，批号：161202）；微晶纤维素（MCC，湖州市菱湖新望化学有限公司，批号：P101D0516N09）；无水乳糖（DMV-Fonterra Excipients GmbH & Co.KG，Germany，批号：10147P9）；交联聚维酮（PVPP XL-10，上海源叶生物科技有限公司，批号：B22A7S19749）；丙烯酸树脂EUDRAGIT^® L30D-55（以下简称L30，批号：B170314162）、丙烯酸树脂EUDRAGIT^® FS30D（以下简称FS30，批号：C170265001）购自Evonic Rolm GmbH公司；羟丙甲基纤维素（HPMC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批号：K1717099）；柠檬酸三乙酯（TEC，上海昌为医药辅料技术有限公司，批号：170712）；水为重蒸水，其他试剂均为分析纯。

色谱柱：依利特Hypersil BDS C₁₈柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氢钾（0.5%三乙胺，磷酸调至pH=3）等度洗脱，比例：30∶70，流速1.0 ml/min，紫外检测波长345 nm，柱温25 ℃，进样量20 μl。

精密称取盐酸小檗碱对照品1.0 mg，用甲醇溶解定容于10 ml容量瓶中作为储备液，将此储备液用甲醇逐级稀释成系列对照品溶液，进样测定。取少量肠溶微丸研碎，称取一定量粉末，加入甲醇，超声提取30 min，3 000 r/min离心后取上清，定容后过0.45 μm滤膜得到供试品溶液。同法制备空白辅料溶液。方法学考察表明，盐酸小檗碱在（0.05～50.00）μg/ml浓度范围内线性关系良好，回归方程为：Y=100 513X−5 262.7（r=0.999 9）。甲醇、空白辅料对肠溶微丸中盐酸小檗碱的含量测定没有干扰，专属性良好（图1）。取浓度为10.0、20.0和50.0 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液连续进样6次，连续测定3 d，记录色谱图峰面积，得到3个浓度的盐酸小檗碱的日内精密度结果分别为0.19%、0.42%、1.52%，日间精密度分别为0.58%、1.43%、1.28%。称取适量黄连提取物，分别加入浓度为10.0、20.0、50.0 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液，超声提取30 min，3000 r/min离心后取上清液，定容后过0.45 μm滤膜，进样测定，记录色谱图峰面积，加样回收率RSD分别为0.85%、1.90%、0.60%，表明该方法可用于肠溶微丸中盐酸小檗碱的含量测定。

载药量、填充剂比例、润湿剂和黏合剂的用量对微丸的成型起到至关重要的作用。因此，我们采用单因素筛选的方法对上述4个因素进行了考察，评价的指标分别为微丸的圆整度、目标微丸的收率和物料黏性。

根据处方，黄连提取物与防风提取物的比例为15∶12。固定MCC：乳糖=5∶2，PVPP用量5%，水为润湿剂，6% HPMC为黏合剂。考察载药量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响，结果见表1。

同样采用单因素筛选的方法分别对填充剂比例、润湿剂用量和黏合剂用量进行了考察。固定载药量为27%，以水为润湿剂，PVPP用量为5%，6% HPMC为黏合剂，考察MCC与乳糖之比对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响；固定载药量为27%，PVPP用量5%，6% HPMC为黏合剂，考察润湿剂的用量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响；固定载药量为27%，PVPP用量5%，水为润湿剂，考察黏合剂6% HPMC的用量对微丸圆整度、收率及物料黏性的影响。

根据单因素实验的结果，综合考虑微丸圆整度、收率和物料黏性等因素，最终确定优化后的丸芯处方为：载药量27%，PVPP 5%，MCC与乳糖之比5∶2，润湿剂占干物料比重30%，黏合剂占干物料比重20%，并以此条件制备3批丸芯进行验证试验，结果表明处方配比合理。

选取挤出速度、滚圆速度和滚圆时间进行三因素三水平正交实验，对工艺参数进行优化。按照表2分组进行微丸的制备，每组按投入干物料100 g进行实验。计算目标微丸收率Y（%，18～30目）和微丸圆整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）作为评价指标。

结果表明，3个因素对综合评分的影响顺序为B>A>C，表3方差分析结果表明，3个因素对综合评分并无显著影响(P>0.05)。考虑到实际实验过程中较大的滚圆速度有利于减少微丸细粉的产生并提高生产效率，最终确定优化后的工艺参数为A₁B₂C₃，即挤出速度20 Hz，滚圆速度700 r/min，滚圆时间7 min。

药物在溶出时，完整的包衣膜决定了微丸内部和介质之间存在一定的渗透压差。丸芯内外压差对药物的释放影响作用较大，因此，在处方筛选过程中，必须考察丸芯的隔离情况^[11]。包制隔离衣后，也使后续包制的肠溶衣膜厚度更加均匀，保证了包衣过程的连续性。固定丸芯原辅料比例不变，分别考察了隔离衣增重为2%、4%、6%和8%时肠溶微丸中盐酸小檗碱的释放情况，累积释放曲线如图2A。结果表明隔离衣增重对累积释放度的影响不显著，最终采用4%的HPMC溶液进行隔离衣的包制，包衣增重为丸芯重量的2%。

聚合物比例、增塑剂用量和包衣增重是调节膜控型微丸释药速率的3个关键因素。因此，同样采用单因素筛选的方法对上述3个因素进行考察，并绘制不同参数下的累积释放曲线。

固定微丸的隔离衣增重为2%，肠溶衣增重为15%，考察聚合物不同比例对盐酸小檗碱累积释放度的影响，累积释放曲线如图2B所示，结果表明，当L30与FS30之比为1∶2，符合对累积释放度设定的标准。

固定L30与FS30之比为1∶2，包衣增重为15%，考察增塑剂用量占干聚物比例为5%、10%、15%、20%和25%时对微丸中盐酸小檗碱累积释放度的影响。图2C结果表明，当增塑剂用量为10%～25%时，药物释放基本满足给定的标准，但实际操作中发现增塑剂用量变大时，微丸包衣难度加大，易产生粘连现象。最终将增塑剂用量定为10%，既能满足释放要求，又能保证较高的生产效率。

最后对包衣增重进行筛选，固定L30与FS30之比为1∶2，考察包衣增重为5%、10%、15%和20%时对微丸中盐酸小檗碱累积释放度的影响，结果如图2D所示，当包衣增重为15%时，满足对累积释放度设定的标准。

根据单因素筛选的结果，最终确定包衣处方为：隔离衣增重2%，L30与FS30之比为1∶2，增塑剂用量10%，包衣增重为15%。按此处方制备3批微丸进行验证试验，工艺参数如下：喷嘴直径1 mm，输液管直径3 mm，雾化压力1.8 bar，蠕动泵转速2.5 r/min，进风温度32 ℃，进风量50 cm²，干燥温度28 ℃，干燥时间30 min。结果表明，据此条件制备的肠溶微丸满足对累积释放度设定的标准。

采用饱和水溶液法制备包合物。称取规定量的β-CD加入10倍蒸馏水，置于70 ℃的恒温水浴锅中，搅拌使成饱和溶液。在30 ℃下边搅拌边缓慢滴加一定量（挥发油与β-CD之比为1∶6）白术挥发油（用无水乙醇预先配置成1∶1的溶液），恒温搅拌1.5 h，冷却至室温，在4 ℃冰箱中冷藏24 h，抽滤后用无水乙醇冲洗3次（每次10 ml），40 ℃干燥4～5 h即得白术挥发油β-CD包合物^[12]。

参照肠溶微丸的处方筛选过程，对胃溶微丸的处方同样进行单因素筛选。实验过程中发现，包合物由于粉末较为细腻，在与微晶纤维素和乳糖混合后，仅需加入少量水作为润湿剂就可以得到塑性良好的湿物料，且易于挤出-滚圆成丸，因此，胃溶微丸的处方中不再添加黏合剂。仅对载药量、填充剂比例和润湿剂用量进行考察。经单因素实验筛选后最终确定优化后胃溶微丸的丸芯处方为：载药量50%，PVPP5%，微晶纤维素与乳糖之比2∶1，润湿剂占干物料比重40%，并以此条件制备3批丸芯进行验证试验，结果表明处方可行。

同样选取挤出速度、滚圆速度和滚圆时间进行三因素三水平正交试验对工艺参数进行优化。按照表4分组进行微丸的制备，每组按投入干物料100 g进行实验。计算目标微丸收率Y（%，16～24目）和微丸圆整度（θ），并以微丸的成球性（Y-2θ）为评价指标。

实验结果表明，3个因素对综合评分的影响顺序为B>C>A，方差分析结果（表5）表明，3个因素对综合评分并无显著性影响(P>0.05)。考虑到简化制备过程以降低成本，最终确定优化后的工艺参数为A₁B₁C₂，即挤出速度20 Hz，滚圆速度500 r/min，滚圆时间5 min。

配制浓度为4%的HPMC溶液，流化床底喷包衣进行胃溶衣的包制，包衣增重为2%。包衣参数如下：喷嘴直径1 mm，输液管内径3 mm，雾化压力1.5 bar，蠕动泵转速2.5 r/min，进风口温度45 ℃，进风量50 m³/h，干燥温度40 ℃，干燥时间30 min。

将胃溶微丸与肠溶微丸按照质量比1∶1的比例装入0号硬质胶囊，得到白术黄连微丸口服结肠靶向胶囊。

按照《中国药典》2015版四部通则0931溶出度与释放度测定法第二法：桨法，评价肠溶微丸的释药特性。溶出介质体积为750 ml，转速100 r/min，温度（37±0.5）℃。分别在pH 1.2的人工胃液中释放2 h，pH 6.8的人工小肠液中释放4 h，pH7.6的人工结肠液中释放18 h，溶出介质体积均满足漏槽条件。分别于1～14 h之间每1 h一次，14～24 h之间每2 h一次，定时取样1 ml，随后立即补加同温同体积介质1 ml，将收集的样品过0.45 μm滤膜后按照“2.1.1”项下方法进样测定，计算体外累积释放度，释放曲线如图3所示。结果表明，按照最优处方制备出的肠溶微丸在人工胃液中2 h基本不释放，人工小肠液中4 h累积释放量小于10%，人工结肠液中缓慢释放，24 h基本释放完全，兼具缓释和结肠靶向的特性。

将肠溶微丸的释药曲线分别按零级、一级和Higuchi方程进行拟合^[13]，得到的结果如表6所示。结果表明，其释放行为符合Higuchi方程释药模型（r=0.9054）。

本研究首先将处方中黄连的有效成分黄连生物碱和防风的有效成分色原酮、多糖等采用L30与FS30混合包衣，制备肠溶微丸；再将白术的有效部位——挥发油类成分通过环糊精包合成挥发油β-CD包合物，制备成胃溶微丸；然后将两种微丸按比例混合装入胶囊，得到口服结肠靶向胶囊。药物口服后，能够发挥“两步释放”的效果，白术的有效成分首先在胃内释放；黄连生物碱和防风色原酮等成分在结肠部位缓慢释放，二者合一，体现了中医药整体与局部相结合的治法治则^[14]。

肠溶微丸的制备采用挤出-滚圆工艺和流化床包衣技术，工艺稳定性和重现性好，适用于工业化大生产。肠溶微丸中药物的释放主要通过膜控来实现，而高分子材料丙烯酸树脂L30和FS30分别在pH>5.5和pH>7.0环境中溶解。因此，可通过混合并调节两者的用量，获得在小肠末端开始释放，到达结肠后大量释放的混合材料，起到缓释和结肠定位的双重作用。同时，本研究使用混合材料进行单层衣膜的包制，简化了包衣步骤，降低了多层包衣造成的成本损耗。依据本实验处方工艺连续制备3批肠溶微丸，释放度结果显示该3批微丸均具有良好的缓释效果，且批间差异小，表明本处方工艺合理，简单易行，重现性良好，适用于工业化生产。

经口服进入胃内的药物在2～4 h后基本会全部通过，随后进入小肠继续吸收，这一过程需要5～6 h，最后进入结肠被进一步重吸收，12～24 h后才会排出体外^[15]。因此，将微丸中盐酸小檗碱的释放度标准定为，在pH1.2的人工胃液中2 h基本无释放（<5%），pH6.8的人工小肠液中4 h累积释放度<10%，pH7.8的人工结肠液中6 h累积释放度>60%。聚合物比例决定了肠溶衣膜溶解的速率，进而影响药物的释放度。适量增塑剂的加入可降低玻璃化温度和最低成膜温度，有助于提高包衣膜的完整性，柠檬酸三乙酯类的增塑剂还能够增加包衣膜的柔性。通过对包衣增重的调整，也可以使药物的释放度符合预期的设计。

将白术挥发油包合后，能够有效掩盖药物的不良气味，同时增加有效成分的稳定性，实现了液体药物向固体制剂的转化。胃溶微丸在口服后，表面衣膜与介质接触后不断溶胀，由于溶胀层较薄，丸芯中的MCC和乳糖吸水后大幅膨胀导致微丸迅速崩解成细颗粒，溶出介质将包合物溶解后形成浓度差，促进了药物的扩散释放，有利于药物迅速吸收入血，发挥全身作用。