Role of cGAS-cGAMP-STING pathway in antivirus

STING是一种完整的内质网（ER）膜蛋白，可通过结合cGAS合成的2'3'-cGAMP形成二聚体，招募TBK1，磷酸化IRF3，从而使一系列的信号传递下去，最后诱导干扰素的产生。研究者早期认为cGAMP只存在于细菌等低等生物细胞中，直到2013年发现哺乳动物细胞中也含有cGAMP^[2]。cGAMP作为第二信使，可以直接结合STING并活化STING及其上游关键合成酶cGAS。2012年陈志坚团队^[3]检测到cGAS能感知到胞质DNA的存在，并激活一系列炎症反应。胞质DNA与cGAS结合，诱发cGAS的催化中心发生构象改变，把GTP和ATP转化为cGAMP。 Swanson等^[4]发现cGAMP除了激活Ⅰ型IFN外，还激活了炎性小体，抑制DNA病毒的感染。

有研究显示，真核细胞中的cGAS-cGAMP-STING信号通路的抗病毒作用有着古老的进化起源，其进化于微生物对噬菌体的防御机制^[5]。越来越多的研究发现该通路在癌症、抗病毒、抗炎症反应和疫苗研发等领域都是一个十分具有前景的医疗靶点^[6-9]。

cGAS-cGAMP-STING信号通路是被内源性和外源性的DNA所激活，因此，该通路主要针对DNA病毒起作用。DNA病毒主要包含疱疹病毒（HSV）、腺病毒（ADV）、伪狂犬病毒（PRV）、痘病毒（Poxvirus）和乙肝病毒（HBV）。cGAS-cGAMP-STING通路对DNA病毒的影响作用取决于DNA病毒种类，另外，相比于抑制病毒的复制，cGAS-STING通路更倾向通过抑制旁观者细胞（bystander cell）的传播来发挥抗病毒作用^[10]，如卡波济肉瘤病毒（KSHV）。在人细胞模型、小鼠细胞模型和小鼠动物模型中，HSV-1感染后，STING促使NLRP3（NOD-like receptor protein 3）定位于内质网，并促进NLRP3的脱泛素化从而激活炎性小体，使得cGAS-cGAMP-STING-NLRP3在抗HSV-1感染中起到了重要作用^[11-12]。β-连环蛋白可以促进cGAS-cGAMP-STING通路中Ⅰ型IFN的产生，从而更好地发挥抗HSV-1的作用。HSV-1的US3是HSV-1壳外蛋白，可作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，HSV-1可通过US3高度磷酸化β-连环蛋白以抵消β-连环蛋白的抗HSV-1作用^[13]。Li等^[14]通过IP和nano-LC-ESI-MS / MS分析进行的公正筛选已确定三结构域蛋白家族21（TRIM21）是泛素E3连接酶，能促进γ-干扰素诱导蛋白16（IFI16）进出，引起IFI16蛋白进入泛素-蛋白酶体途径降解，IFI16-K3 / 4 / 6R突变可延长IFI16的半衰期，诱导更多STING依赖性I型IFN和下游干扰素刺激基因（ISGs）表达，从而使细胞对HSV-1病毒感染更具有抵抗力。Zhou等^[15]的研究发现阴离子通道LRRC8/VRAC是一个跨细胞膜转运cGAMP的转运蛋白，能将HSV-1感染细胞产生的cGAMP转运到非感染细胞中，激活STING信号和干扰素应答，从而发挥抗HSV-1作用。

另外，cGAS-cGAMP-STING通路在抗人类巨细胞病毒 (HCMV)中发挥着重要作用^[16]。STING高表达可以显著降低HCMV在人成纤维细胞中的复制^[17]。

Wang等^[18]研究发现猪干扰素诱导的跨膜蛋白1（pIFITM1）是宿主抑制PRV感染的限制性因素，而PRV诱导的pIFITM1的表达依赖于cGAS-cGAMP-STING先天性免疫信号通路和Ⅰ型IFN受体。Cheng等^[19]研究表明，cGAS-cGAMP-STING途径对于感知鼠痘病毒（ECTV）感染，诱导Ⅰ型IFN产生以及控制ECTV复制至关重要。ECTV是一种研究宿主与正痘病毒关系的有价值模型。实验表明，缺乏cGAS或STING的小鼠表现出较低的Ⅰ型IFN水平和较高的病毒载量，并且对鼠痘更敏感。但是，其对ECTV反应的作用目前尚不清楚。

Ito等^[20]设计了STING通路的配体cGAMP作为HBV疫苗佐剂功效的动物实验，使野生型（WT）和HBV转基因（HBV-Tg）小鼠均接种乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和cGAMP，结果发现HBsAg和cGAMP的疫苗接种显著增强了WT和HBV-Tg小鼠对HBsAg的体液免疫和细胞免疫反应。cGAMP诱导了与辅助性T细胞1（Th1）和Th2响应相关的细胞因子的释放，并诱导激活了淋巴组织中的抗原呈递细胞。基于以上实验，Ito等认为cGAMP进行疫苗接种可以克服慢性HBV感染患者的耐受性。

Pepin等^[21]证明cGAMP依赖连接蛋白转移至吞噬细胞可以调节抗DNA病毒效应，使上皮细胞和巨噬细胞共培养，上皮细胞中的cGAMP可以直接转移至巨噬细胞胞内，从而反式激活巨噬细胞中STING信号通路。cGAMP的转移依赖于上皮细胞中连接蛋白的表达，抑制连接蛋白的表达会使该途径的STING通路的激活减弱。cGAMP反式激活巨噬细胞又起到了正反馈的作用，放大了STING通路的抗病毒作用。Wang等^[22]发现通过增加DNA传感器cGAS及其下游衔接蛋白STING的敏感性来对抗DNA病毒，此反应中Mn²⁺是必需的。Mn²⁺增强了cGAS对dsDNA的敏感性及其酶促活性，Mn²⁺还通过增加cGAMP-STING结合亲和力来增强STING活性。这些发现表明，Mn²⁺是宿主抵御DNA病毒的关键物质。

虽然登革热病毒（DENV）是一种生命周期中没有DNA阶段的RNA病毒，它也可以通过STING的蛋白水解作用来操纵cGAS-STING介导的先天性免疫。Su等^[23]进行的共培养细胞模型发现，随着人STING单倍型的不同，STING对DENV蛋白酶的敏感性也不同，在DENV感染后控制细胞因子的产生和病毒复制的效果也不同。外源重新激活的病毒DNA进一步增强了DENV蛋白酶与STING相互作用和裂解的能力。DENV感染会降低具有蛋白酶敏感性STING单倍型细胞的宿主先天性免疫。然而，研究者在鼠类和非人灵长类动物中也发现了对登革热蛋白酶耐受的STING，揭示STING可能是不同物种限制登革热病毒复制的一种宿主因子。

Gutjahr等^[24]通过在鼻内单独给HIV-1 Gag p24纳米颗粒（NP-p24）或与2'3'-cGAMP合用一起接种于CB6F1小鼠，发现相对于单独接种NP-p24的小鼠，用NP-p24加2'3'-cGAMP接种的小鼠的病毒复制得到了更为有效的控制，且小鼠的黏膜和全身性HIV-1 Gag p24特异性IgA和IgG滴度非常高，但是，在单独接种NP-p24的小鼠中并未检测到。cGAMP并行引发体液免疫反应的能力，包括在黏膜表面分泌IgA，可能对某些病毒感染（如HIV-1）有作用。

Hou团队^[25]基于细胞分析，从合成的小分子中鉴定出具有吖啶酮骨架的化合物2g、9g和12b是STING激动剂，它们在整个物种中均是STING的激动剂。其中，12b活性最好，并且其对人和鼠STING依赖性信号的诱导均与2'，3'-cGAMP相似。蛋白质分析表明2g、9g和12b可以通过直接与STING结合从而激活STING通路，而12b与STING的亲和力更强。而且与2'，3'-cGAMP相比，12b可以诱导各种细胞因子产生更快，更强劲和更持久的免疫应答。基于此，团队首次成功修饰鼠STING激动剂以获得人类敏感性，这些结果表明，12b是有效的人STING激动剂。此外，吖啶酮类似物显示出巨大的抗病毒或抗肿瘤治疗潜力。Zhang等^[26]报道了基于细胞的高通量筛选测定法，该测定法可用于鉴定小分子cGAS-cGAMP -STING途径激动剂，发现6-溴-N-（萘-1-基）苯并[d][1,3]二唑-5-羧酰胺（BNBC）是cGAS-cGAMP -STING途径的激动剂，不仅可以诱导针对多种病毒的先天抗病毒免疫力，而且还可以刺激适应性免疫应答的激活。Lian等^[27]的研究发现CCHC型锌指蛋白3（ZCCHC3）缺乏抑制dsDNA和DNA病毒触发的下游效应基因的诱导，ZCCHC3直接与dsDNA结合，增强cGAS与dsDNA的结合，这对病毒感染后cGAS的激活很重要。Ku等^[28]发现了类鼻疽杆菌T6SS5依赖性细胞融合触发宿主中的Ⅰ型IFN基因表达，并导致cGAS-STING通路激活，cGAS和STING的激活导致自噬细胞死亡。他们提出：cGAS–STING途径通过微核形成将异常的细胞融合感知为危险信号，并因此通过自噬死亡的诱导限制异常的被病毒感染的细胞分裂和限制潜在的细胞转化。Palermo等^[29]的研究发现，STING激动剂cGAMP与FDA批准的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂（resminostat）的组合可显著增加HIV感染前细胞的HIV前病毒激活率和特异性凋亡，降低HIV感染细胞的比例并在CD4（+）中央记忆T（TCM）细胞中观察到了HIV DNA的总量，该研究通过减少病毒库并诱导HIV感染细胞的特异性死亡，代表了一种消除HIV的新策略。

Kawasaki等^[30]发现STING转运受到肌管蛋白相关蛋白（MTMR）3和MTMR4的调节，而MTMR3和MTMR4可以调节PtdIns3P（磷脂酰肌醇）的产生，PtdIns3P可通过调节STING转运来抑制DNA介导的先天免疫应答，并发挥关键作用。Ghosh等^[31]研究发现I型干扰素诱导型人寡腺苷酸合成酶样蛋白（OASL）是cGAS-cGAMP-STING途径的负反馈调节剂，OASL独立于双链DNA，直接且特异性地与cGAS结合，从而与第二信使cGAMP产生非竞争性抑制，起到负反馈调节cGAS-cGAMP-STING通路的作用。Jia等^[32]的研究发现，病毒感染导致胞内脂质过氧化水平升高，产生4-羟基壬烯酸（4-HNE）等脂质过氧化代谢产物，促进STING羰基化、抑制STING活化。谷胱甘肽过氧化物酶（GPX4）通过将高反应性脂质过氧化物(L-OOH)转化为低反应性脂质醇(L-OH)，保护细胞免受脂质过氧化作用并维持胞浆内氧化还原平衡。而GPX4缺陷通过增强脂质过氧化可进一步促进4-HNE产生、特异性抑制cGAS-STING介导的DNA识别通路，从而抑制抗DNA病毒免疫反应。Huang等^[33]确定HCMV蛋白UL31作为cGAS的抑制剂。UL31直接与cGAS相互作用，并使DNA与cGAS分离，从而抑制cGAS的酶功能并降低cGAMP的产生。UL31的过表达有效抑制抗病毒应答，而敲低或敲除UL31则明显增强了HCMV诱导Ⅰ型IFN和下游抗病毒基因的生成。Fu等^[34]的研究结果表明HCMV UL42也是cGAS依赖性抗病毒反应的抑制剂。

近几年，人们在理解胞质DNA传感和信号转导方面取得显著进步，尤其是在cGAS和cGAMP鉴定方面取得重大突破。大量证据清楚地表明cGAS-cGAMP-STING途径在抗病毒中的作用，这归因于胞浆DNA的识别和Ⅰ型IFN的产生。cGAMP可有效抗病毒复制，延长病毒滞留时间，延长生存周期，因此，可用于制备治疗HBV、HCV等病毒的药物。cGAS激活典型的模式识别受体（PRRs）通路，通过STING上调IFNs的表达，进而诱发抗病毒的活性。最近报道，该通路的激动剂具有良好的抗病毒作用，有望进一步开发为抗病毒新药。

尽管cGAS-cGAMP-STNG通路被发现和研究多年，但是STNG信号相关的网络结构并不完善，其与其他通路如caspase 1/9、STAT、NF-κB等的交互作用并不是完全清楚，接下来的工作需要完善该信号网络，为基于靶点的药物设计提供药理机制基础。