-
疲劳的定义为机体生理过程不能维持其机能在一特定水平上，或不能维持预定的运动强度[1]。由于疲劳的分子机制并不清楚，目前并无真正官方认可的抗疲劳药物。一些天然产物，如人参、红景天、大蒜等，以及营养补充剂，如维生素、矿物质和肌酸等，报道有抵抗肌肉疲劳、提高运动成绩的效应，但是效果缓慢而不显著[2]；苯丙胺、莫达非尼、咖啡因等药物虽能快速改善疲劳，但实质为中枢兴奋药，存在成瘾、耐受、改变生物节律等问题[3]。因此，抗疲劳药物的进一步研发，对改善生活质量、提升运动成绩、提高军事作业能力有重要意义。
组织糖原含量与疲劳的发生密切相关[4]。本课题组通过大规模化合物合成和筛选，获得了一个全新小分子化合物HMS-01，可以通过促进肝脏和肌肉组织糖原的储存，改善疲劳后组织损伤，显著增加肌肉耐力，发挥抗疲劳的作用。为了进一步了解HMS-01的药动学特点以及在组织中的分布，本课题组采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术[5-6]，研究建立灵敏、特异的测定血浆等生物样品中HMS-01浓度的分析方法，并开展HMS-01在大鼠体内的药动学研究，为后续药物研发提供理论依据。
HTML
-
Agilent 1290 InfinityⅡ液相色谱仪（Agilent Technologies，美国）、4000 Q-Trap型串联质谱仪(AB Sciex，美国)；低温高速离心机（Thermo，德国）；XW 80A型涡旋混合器（医大仪器，上海）；Mettler AE240十万分之一电子天平（梅特勒-托利多，瑞士）；Millipore-Q超纯去离子水净化仪（Millipore，美国）。
-
HMS-01（西安秦申嘉合药物研究有限公司，批号HMS-1-1010-3）；罗红霉素（Sigma，CAS：2058-46-0）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical）；甲酸（色谱纯，Fisher Chemical）；其他试剂为市售分析纯。
1.1. 仪器
1.2. 试药
-
色谱柱为Gemini C18(50 mm×2.0 mm, 5 μm)，流动相：含5 mmol甲酸铵及1 mmol甲酸的水溶液(A)-含1 mmol甲酸的乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱程序如下：0~2 min，90% A；2~6 min，5% A；6~8 min，90% A。流速：0.35 ml/min，柱温：25 ℃，进样量5μl，运行时间8 min。
-
采用ESI正离子模式，多反应离子监测模式(MRM)进行二级扫描；动态反应监测的离子对参数：HMS-01 772.5→614.5；罗红霉素（IS）837.5→158.1。离子源参数设置：干燥气温度350 ℃；干燥气流速10 L/min；雾化器压力40 psi；鞘气温度400 ℃；鞘气流速11 L/min；毛细管电压4 000 V；喷嘴电压500 V。HMS-01保留时间为2.834 min，罗红霉素保留时间为2.839 min，色谱图如图1所示。
-
精密称取HMS-01对照品772.5 mg，置于10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为77.25 mg/ml对照品储备液。再采用逐级稀释法配置质量浓度为772.5、386.25、193.125、96.563、48.281、24.141、12.070、6.035、3.018、1.509、0.754 ng/ml的系列含对照品血浆溶液；随行质控样品中HMS-01的低、中、高质量浓度分别为3.09、30.9、618 ng/ml。以上溶液置于4 ℃冰箱备用。
-
取50 μl血浆样品于离心管中，加入200 μl（含41.875 ng/ml的IS内标）乙腈溶液，涡旋60 s，4 ℃条件下3 000×g离心10 min，取上清液进样。
-
按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备标准曲线，平行操作5份，按上述LC-MS/MS条件，连续进样分析，以对照品浓度(X)为横坐标，HMS-01的峰面积与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，进行线性回归，得线性方程：
Y=0.009 3 X+0.005 08, r = 0.999 3，
线性范围为0.976~1 000 ng/ml，以信噪比为3或5时测得HMS-01的最低定量限均为976 pg/ml。
-
按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备低、中、高3种浓度的质控样品，平行操作5份，连续3 d，计算实测浓度。如表1所示，精密度用相对标准偏差(RSD)表示，结果日内精密度RSD≤12%，日间精密度RSD≤9%；准确度以相对回收率表示，实测浓度与理论加入浓度的比值即为相对回收率。结果表明日内、日间结果准确度范围在87%~106%。
浓度(ng/ml) 日内 日间 实测浓度(ng/ml) 精密度(%) 准确度(%) 实测浓度(ng/ml) 精密度(%) 准确度(%) 3.09 2.71±0.27 7.7 87.9 2.71±0.27 7.5 87.9 30.9 31.4±4.8 11.8 102 32.6±3.6 8.4 106 618 618±46 5.8 100 618±46 5.4 98.4 -
按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备低、高2种浓度含药血浆，平行操作6份；取空白血浆按“2.4”项下处理，甲醇代替内标溶液，取处理好的空白血浆样品加入相应浓度对照品溶液，使之浓度与待测物的峰面积理论浓度一致，分别制备6份；将待测化合物标准溶液用甲醇稀释，使之与待测物的峰面积理论浓度一致，进样6次。基质效应等于（含基质样品的峰面积）/（80%乙腈溶液的峰面积），提取回收率等于（待测物的峰面积）/（含基质样品的峰面积），考察内标的基质效应和提取回收率操作步骤同上。低、高两种浓度待测物及内标提取回收率均在60%~75%之间，基质效应均在5.6%~6.1%之间，具体结果见表2。
待测物 浓度(ng/ml) 提取回收率(%) 基质效应(%) HMS-01 3.09 68±3 6.1 618 63±4 5.7 内标 3.35 73±2 6.1 670 73±2 5.6 -
按“2.3”项和“2.4”项中的方法制备低、高2种浓度含药血浆，分别考察样品前处理后室温放置24 h，3次冻融循环以及-70 ℃保存30 d的稳定性，测定样品浓度，计算平均值，并计算RSD(%)及相对偏差RE(%)，计算公式：RE%=（实测值−真实值）/真实值×100%。结果见表3。测定结果的RE范围为2%~17%，RSD均小于7%，表明样本稳定性良好。
条件 浓度(ng/ml) RSD(%) RE(%) 室温24 h 3.09 3.7 16.5 618 1.0 2.6 3次冻融循环 3.09 6.7 4.5 618 0.6 5.9 –70 ℃保存30 d 3.06 6.8 8.7 6.18 0.6 10.1 -
SD大鼠12只，分成2组，每组6只，雌雄各半。给药前禁食12 h，自由饮水。按30 mg/kg的剂量单次灌胃、1 mg /kg的剂量单次静注给药。灌胃给药的，于给药前和给药后5、10、20、30 min和1、1.5、2、4、6、8、10、12、24 h分别眼眶采血约100 µl；静注给药的，于给药前和给药后3、8、15、30 min和1、2、3、4、6、8、10、12、24 h分别眼眶采血约100 µl。血液用1%肝素抗凝，8 000×g离心5 min，分离血浆。–70 ℃保存待测。采血过程冰浴避光，以防止光对药物稳定性产生影响。
大鼠单次静注给予1 mg/kg HMS-01后的药动学参数（非房室模型）总结于表4。大鼠静脉注射1 mg/kg HMS-01后，雄、雌大鼠药动学参数血浆浓度-时间曲线下面积（AUC）、平均清除率（CL）显示有极显著性差异（P<0.01），药动学参数血浆消除半衰期（t1/2）、表观分布容积（V）均呈显著性差异（P<0.05）。雄性大鼠AUC0-t为221 ng·h/ml，CL为4.53 L/h·kg，为大鼠肝脏血流量（约3.3 L/h·kg）的137%，体内清除快， t1/2约为0.786 h，V为5.13 L/kg；雌性大鼠AUC0-t为409 ng·h/ml，CL为2.41 L/h·kg，为大鼠肝脏血流量的73%，体内清除较快， t1/2约为1.27 h，V为3.82 L/kg。
性别 AUC0-t (ng·h/ml) AUC0-∞ (ng·h/ml) MRT0-∞ (t/h) t1/2z (t/h) CLz (L/h·kg) Vz (L/kg) cmax (ng/ml) 雄性 221±12.6 221±12.4 0.776±0.022 0.786±0.039 4.53±0.252 5.13±0.388 491±112 雌性 409±23.3** 416±21.0** 1.270±0.115 1.090±0.141* 2.41±0.120** 3.82±0.666* 571±55.1 合计 315±105 319±108 1.030±0.282 0.940±0.193 3.47±1.17 4.47±0.871 531±90.3 大鼠单次灌胃给予30 mg/kg HMS-01后的药动学参数（非房室模型）总结见表5。灌胃给予30 mg/kg HMS-01后，雄、雌大鼠药动学参数AUC显示有极显著性差异（P<0.01），药动学参数CL、F显示有显著性差异（P<0.05）。在大鼠体内血浆浓度达峰时间tmax为1.17 h，达峰浓度cmax为1 243 ng/ml，消除半衰期t1/2为2.00 h。雄、雌大鼠AUC0-t分别为2 271和8 529 ng·h/ml，生物利用度分别为34.3%和69.5%。
性别 AUC0-t (ng·h/ml) AUC0-∞ (ng·h/ml) MRT0-∞ (t/h) t1/2z (t/h) tmax (t/h) CLz/F (L/h·kg) Vz/F (L/kg) cmax (ng/ml) F（%） 雄性 2 271±666 2 279±667 2.58±0.156 1.43±0.130 1.17±0.289 14.00±4.31 28.5±7.04 729±263 34.3±10.1 雌性 8 529±1 920** 9 071±1 529** 4.79±1.39 2.58±1.060 1.17±0.289 3.38±0.629* 13.1±7.78 1757±584 69.5±15.6* 合计 5 400±3 661 5 675±3 867 3.68±1.50 2.00±0.924 1.17±0.258 8.69±6.44 20.8±10.7 1 243±694 51.9±22.6
2.1. 色谱条件
2.2. 质谱条件
2.3. 标准曲线溶液的配制和质控样品的制备
2.4. 血浆样品前处理方法
2.5. 线性关系考察
2.6. 精密度试验
2.7. 基质效应和提取回收率
2.8. 稳定性试验
2.9. HMS-01药动学研究
-
HMS-01在大鼠体内的药动学过程存在显著的性别差异。口服吸收的比较，雌性大鼠的生物利用度远高于雄性，体内的清除速率方面，雌性比雄性慢，与此同时，HMS-01在雌性体内的半衰期也更长。存在性别差异的原因有待进一步深入研究。本实验采用的分析方法的特异性、灵敏性、准确性、精密度及稳定性均满足定量分析的要求。鉴于HMS-01在大鼠血浆中不稳定的情况，在做动物实验时，课题组将采取以下措施：全血采集后立刻在4 ℃下离心2 min获取血浆，随即立刻取50 µl血浆样品加入至200 µl含内标的乙腈中，从而阻断血浆中的水解酶对化合物进行水解。
DownLoad: